分享一篇最近發(fā)表在ChemistryOpen上的文章，題目為Synthesis and properties of RNA containing constrained by a 2’-O-disulfide bridge。這篇文章的通訊作者是來自法國蒙彼利埃大學(xué)的Christelle Dupouy教授。
核酸在各種生物過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，此外也在對抗疾病的發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。其中，結(jié)構(gòu)受約束的核酸在生物學(xué)和納米技術(shù)中有多種應(yīng)用，許多用于治療目的的核苷酸的糖部分都會被化學(xué)設(shè)計(jì)來限制它們的構(gòu)象靈活性，或者用于調(diào)節(jié)核酸結(jié)構(gòu)的折疊。但目前這些工作使用的約束結(jié)構(gòu)大多數(shù)是通過共價鍵形成的，對于由動態(tài)共價鍵形成的受約束核酸體系關(guān)注有限。
在之前的工作中，作者合成了2'-O-乙?；蚣谆?/span>腺苷，并發(fā)現(xiàn)當(dāng)兩個殘基并排引入寡核苷酸中時，可以誘導(dǎo)形成二亞甲基二硫橋（DME）（圖1）。當(dāng)DME引入RNA雙鏈時，會降低RNA的熱穩(wěn)定性；而在RNA發(fā)夾環(huán)中引入DME時，熱穩(wěn)定性則會提高。對于RNA雙鏈和發(fā)夾結(jié)構(gòu)平衡的體系，作者也證明用DME橋連后平衡向發(fā)夾結(jié)構(gòu)移動，而加入還原劑之后，則主要生成雙鏈。在這篇文章中，作者進(jìn)一步研究了烷基鏈長對RNA雙鏈和發(fā)夾折疊行為的影響，合成不同二硫橋二乙烯（DEE）和二丙烯（DPE）的寡核苷酸，并探究了它們的穩(wěn)定性。
圖1. 將DME，DEE和DPE 二硫橋連接到雙鏈和發(fā)夾RNA中。 作者首先合成了含有不同烷基鏈長的乙酰巰基尿嘧啶磷酰胺，通過固相合成的方式合成了三個含有DME、DEE和DPE的單鏈寡核苷酸ONx（x分別為烷基長度，x = 1, 2, 3），在丁胺和二硫二吡啶處理后就得到了不同類型二硫橋連的單鏈寡核苷酸。（圖2）表1. 不同二硫橋?qū)?/span>RNA雙鏈和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性影響 作者同時合成了ONx的RNA互補(bǔ)鏈（表1，D1-D4）和DNA互補(bǔ)鏈（表1，D5-D8）來探究二硫橋連對雙鏈RNA的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，與未修飾的雙鏈相比，修飾后的雙鏈Tm值均下降，穩(wěn)定性下降。作者認(rèn)為可能是二硫橋影響了堿基之間的堆疊使穩(wěn)定性降低。 為了評估不同二硫橋連對RNA雙鏈-發(fā)夾平衡的影響，作者采用14-mer序列H1作為模型（表1），在缺少互補(bǔ)鏈的情況下，該序列在環(huán)狀部分采用由5個核苷酸組成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)；而在互補(bǔ)鏈存在的情況下形成雙鏈。對于發(fā)夾結(jié)構(gòu)，DME不會影響其熱穩(wěn)定性（H2、H3），DEE（H4、H5）和DPE（H6、H7）的引入使Tm值略微下降，但總體來說不同二硫橋連對發(fā)夾穩(wěn)定性影響較小。圖3. 不同二硫橋?qū)?/span>RNA發(fā)夾酶穩(wěn)定性影響。 作者用3'-核酸外切酶評估了這些修飾對酶穩(wěn)定性的影響。二硫橋位于U7和U8之間的發(fā)夾H4和H6的半衰期與未修飾的發(fā)夾H1相同(t1/2= 20 min)。相比之下，二硫橋在U8和U9之間的發(fā)夾酶穩(wěn)定性提升最高，H3和H5的半衰期為40 min（圖3）。除了二硫橋的位置，烷基鏈的長度也會影響其酶穩(wěn)定性，較長烷基鏈的酶穩(wěn)定性不如較短烷基鏈的酶穩(wěn)定性（H7<H3/H5，H2>H4/H6）。 為了進(jìn)一步研究三種二硫橋?qū)﹄p鏈和發(fā)夾結(jié)構(gòu)平衡的影響，作者使用發(fā)夾H1、H3、H5和H7及其互補(bǔ)鏈在4°C下進(jìn)行非變性凝膠電泳。對于未修飾的H1（圖4A，lane 2），和互補(bǔ)鏈（lane 3）孵育后會主要形成雙鏈（lane 4）；而對于修飾二硫橋的H3（圖4B，lane 4）、H
