分享一篇最近發(fā)表在ChemistryOpen上的文章，題目為Synthesis and properties of RNA containing constrained by a 2’-O-disulfide bridge。這篇文章的通訊作者是來(lái)自法國(guó)蒙彼利埃大學(xué)的Christelle Dupouy教授。
核酸在各種生物過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，此外也在對(duì)抗疾病的發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。其中，結(jié)構(gòu)受約束的核酸在生物學(xué)和納米技術(shù)中有多種應(yīng)用，許多用于治療目的的核苷酸的糖部分都會(huì)被化學(xué)設(shè)計(jì)來(lái)限制它們的構(gòu)象靈活性，或者用于調(diào)節(jié)核酸結(jié)構(gòu)的折疊。但目前這些工作使用的約束結(jié)構(gòu)大多數(shù)是通過(guò)共價(jià)鍵形成的，對(duì)于由動(dòng)態(tài)共價(jià)鍵形成的受約束核酸體系關(guān)注有限。
在之前的工作中，作者合成了2'-O-乙?；蚣谆?/span>腺苷，并發(fā)現(xiàn)當(dāng)兩個(gè)殘基并排引入寡核苷酸中時(shí)，可以誘導(dǎo)形成二亞甲基二硫橋（DME）（圖1）。當(dāng)DME引入RNA雙鏈時(shí)，會(huì)降低RNA的熱穩(wěn)定性；而在RNA發(fā)夾環(huán)中引入DME時(shí)，熱穩(wěn)定性則會(huì)提高。對(duì)于RNA雙鏈和發(fā)夾結(jié)構(gòu)平衡的體系，作者也證明用DME橋連后平衡向發(fā)夾結(jié)構(gòu)移動(dòng)，而加入還原劑之后，則主要生成雙鏈。在這篇文章中，作者進(jìn)一步研究了烷基鏈長(zhǎng)對(duì)RNA雙鏈和發(fā)夾折疊行為的影響，合成不同二硫橋二乙烯（DEE）和二丙烯（DPE）的寡核苷酸，并探究了它們的穩(wěn)定性。
圖1. 將DME，DEE和DPE 二硫橋連接到雙鏈和發(fā)夾RNA中。 作者首先合成了含有不同烷基鏈長(zhǎng)的乙酰巰基尿嘧啶磷酰胺，通過(guò)固相合成的方式合成了三個(gè)含有DME、DEE和DPE的單鏈寡核苷酸ONx（x分別為烷基長(zhǎng)度，x = 1, 2, 3），在丁胺和二硫二吡啶處理后就得到了不同類(lèi)型二硫橋連的單鏈寡核苷酸。（圖2）表1. 不同二硫橋?qū)?/span>RNA雙鏈和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性影響 作者同時(shí)合成了ONx的RNA互補(bǔ)鏈（表1，D1-D4）和DNA互補(bǔ)鏈（表1，D5-D8）來(lái)探究二硫橋連對(duì)雙鏈RNA的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，與未修飾的雙鏈相比，修飾后的雙鏈Tm值均下降，穩(wěn)定性下降。作者認(rèn)為可能是二硫橋影響了堿基之間的堆疊使穩(wěn)定性降低。 為了評(píng)估不同二硫橋連對(duì)RNA雙鏈-發(fā)夾平衡的影響，作者采用14-mer序列H1作為模型（表1），在缺少互補(bǔ)鏈的情況下，該序列在環(huán)狀部分采用由5個(gè)核苷酸組成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)；而在互補(bǔ)鏈存在的情況下形成雙鏈。對(duì)于發(fā)夾結(jié)構(gòu)，DME不會(huì)影響其熱穩(wěn)定性（H2、H3），DEE（H4、H5）和DPE（H6、H7）的引入使Tm值略微下降，但總體來(lái)說(shuō)不同二硫橋連對(duì)發(fā)夾穩(wěn)定性影響較小。圖3. 不同二硫橋?qū)?/span>RNA發(fā)夾酶穩(wěn)定性影響。 作者用3'-核酸外切酶評(píng)估了這些修飾對(duì)酶穩(wěn)定性的影響。二硫橋位于U7和U8之間的發(fā)夾H4和H6的半衰期與未修飾的發(fā)夾H1相同(t1/2= 20 min)。相比之下，二硫橋在U8和U9之間的發(fā)夾酶穩(wěn)定性提升最高，H3和H5的半衰期為40 min（圖3）。除了二硫橋的位置，烷基鏈的長(zhǎng)度也會(huì)影響其酶穩(wěn)定性，較長(zhǎng)烷基鏈的酶穩(wěn)定性不如較短烷基鏈的酶穩(wěn)定性（H7<H3/H5，H2>H4/H6）。 為了進(jìn)一步研究三種二硫橋?qū)﹄p鏈和發(fā)夾結(jié)構(gòu)平衡的影響，作者使用發(fā)夾H1、H3、H5和H7及其互補(bǔ)鏈在4°C下進(jìn)行非變性凝膠電泳。對(duì)于未修飾的H1（圖4A，lane 2），和互補(bǔ)鏈（lane 3）孵育后會(huì)主要形成雙鏈（lane 4）；而對(duì)于修飾二硫橋的H3（圖4B，lane 4）、H
