分享一篇發(fā)表在Science上的文章，文章題目為“Characterization and heterologous reconstitution of Taxus biosynthetic enzymes leading to baccatin III”，本文通訊作者為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)基因組研究所閻建斌教授以及北京大學(xué)化生系的雷曉光教授。閻老師的研究方向?yàn)橹参锎紊x的調(diào)控研究，雷老師研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物的化學(xué)生物學(xué)。
紫杉醇是最富有代表性的天然產(chǎn)物成藥分子。目前用于生產(chǎn)紫杉醇的策略是化學(xué)半合成。該方法從植物細(xì)胞培養(yǎng)物或紅豆杉的原始樹木中分離baccatin III，隨后通過化學(xué)轉(zhuǎn)化為紫杉醇。但這樣的方法也難以滿足市場(chǎng)的需求，隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，以綠色和可持續(xù)的方式生產(chǎn)紫杉醇是非常重要的課題。紫杉醇的生物合成反應(yīng)步驟可分為三個(gè)關(guān)鍵過程，包括從底物香葉基焦磷酸(GGPP)形成紫杉烷骨架，通過C4和C20雙鍵的環(huán)氧化生物合成baccatin III，以及將phenylisoserine鏈連接到baccatin III的C13位置生成紫杉醇。C13側(cè)鏈的形成及其與baccatin III結(jié)合生成紫杉醇的研究已經(jīng)得到了很好闡述。然而，形成baccatin III的幾個(gè)基本步驟仍然未知，特別是環(huán)氧丁烷的形成和C9的氧化。因此，紫杉醇生物合成的上游和下游步驟無(wú)法連接，迄今為止缺乏完整的紫杉醇生物合成途徑。
作者之前的研究表明，CYP725A亞家族只存在于紅豆杉屬，該亞家族包含所有參與紫杉醇生物合成的加氧酶。作者首先根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析將CYP725A亞家族的基因分為三組(I、II和III組)，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化在煙葉中同時(shí)表達(dá)每組中所有基因。當(dāng)農(nóng)桿菌浸潤(rùn)后第4天外源基因表達(dá)達(dá)到較高水平時(shí)，作者將底物注射到進(jìn)行浸潤(rùn)的相應(yīng)葉區(qū)。反應(yīng)一天后，用甲醇提取葉片代謝物，用液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)分析。作者發(fā)現(xiàn)Chr9_74725878(TOT1)可以催化環(huán)氧丁烷的形成。作者隨后根據(jù)生化實(shí)驗(yàn)，推測(cè)了TOT1底物1生成環(huán)氧丁環(huán)的機(jī)制。作者發(fā)現(xiàn)TOT1是一種雙功能加氧酶，它直接將烯烴部分轉(zhuǎn)化為環(huán)氧化物和環(huán)氧丁烷。然而，TOT1不能作為異構(gòu)酶將環(huán)氧環(huán)轉(zhuǎn)化為環(huán)氧丁烷。因此，環(huán)氧化物不是形成環(huán)氧丁烷的必要中間體。
隨后作者利用了乙?；仙纪槿〈孜?，還鑒定了在baccatin III生物合成中缺失的C-9氧化酶(T9αH1)。在鑒定出baccatin III合成的兩個(gè)必需基因(TOT1和T9αH)后，作者嘗試將這兩個(gè)新基因與其他已知參與baccatin III生物合成的基因(TXS、T5αH、T13αH、2α h、T7βH、TAT和TBT)共表達(dá)，以確定是否可以人工重建煙草baccatin III的生物合成途徑。結(jié)果表明，當(dāng)T9αH和TOT1與baccatin III生物合成途徑的7個(gè)已知基因共表達(dá)時(shí)，可以成功檢測(cè)到baccatin III。作者最后認(rèn)為，由于可能存在分叉途徑，煙草中baccatin III的總體產(chǎn)量較低(~50 ng/g DW)。未來(lái)的研究將集中于闡明這9種酶的具體催化順序，并找到速率優(yōu)化的決定步驟。
