介紹一篇2023年發(fā)表在nature communication上的文章，文章的題目是：Rapid and reversible optical switching of cell membrane area by an amphiphilic azobenzene德國(guó)明斯特大學(xué)軟納米科學(xué)中心的Bart Jan Ravoo教授團(tuán)隊(duì)。
脂質(zhì)雙分子層膜是細(xì)胞結(jié)構(gòu)的核心部分，其分子組織和總面積受到胞吞作用和胞吐作用、網(wǎng)格蛋白包被的凹坑和小泡等過(guò)程的嚴(yán)格調(diào)節(jié)。膜面積直接影響膜張力，面積體積比的變化對(duì)細(xì)胞形狀至關(guān)重要。反過(guò)來(lái)，由于缺乏控制細(xì)胞膜面積的實(shí)驗(yàn)工具，許多與細(xì)胞形狀、膜張力穩(wěn)態(tài)和局部膜面積有關(guān)的重要問(wèn)題有待解決。首先作者選取了紅細(xì)胞作為靶細(xì)胞，因?yàn)樾螤羁煽?，且表面體積比的微小變化也會(huì)引發(fā)劇烈的形狀變化。操縱細(xì)胞的幾何形狀方法，一是用特定的兩親性藥物插入到磷脂雙分子層的外或內(nèi)半小泡中，并引起干擾，分別導(dǎo)致棘刺細(xì)胞或氣孔細(xì)胞的形成，導(dǎo)致形態(tài)變化。另一種是改變周圍介質(zhì)的強(qiáng)直性(有效滲透壓梯度)。這兩種方法是可逆的，但操作緩慢(滲透需要幾十秒)，且當(dāng)需要直接觀察細(xì)胞時(shí)，改變周圍介質(zhì)更為復(fù)雜。因而作者提出通過(guò)光照以快速、可逆的方式調(diào)節(jié)紅細(xì)胞和其他真核細(xì)胞(如成肌細(xì)胞和癌細(xì)胞)的膜面積的方法。偶氮苯可以通過(guò)不同波長(zhǎng)的光照實(shí)現(xiàn)快速且高度可逆的光異構(gòu)化，由此將偶氮苯引入膜中即可通過(guò)光異構(gòu)化實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞快速可逆的表面積變化。作者合成了一種兩親性陰離子偶氮苯衍生物，并對(duì)其光物理性質(zhì)進(jìn)行了分析。圖1a顯示了偶氮SO3H的分子結(jié)構(gòu)以及偶氮SO3H在 (DMEM中初始態(tài)和兩種光穩(wěn)定態(tài)(PSS)的紫外/可見(jiàn)吸收光譜。為了證明高效的光異構(gòu)化過(guò)程，測(cè)量了多個(gè)開(kāi)關(guān)周期。圖1b顯示了10個(gè)開(kāi)關(guān)周期。分別用紫外LED（365nm）和藍(lán)色LED（465nm）交替照射10s，通過(guò)347nm處吸光度峰值處測(cè)定了光異構(gòu)化的完成程度。可以看出偶氮苯SO3H沒(méi)有出現(xiàn)疲勞現(xiàn)象，并表現(xiàn)出良好的光異構(gòu)化行為。
圖1 Azo-SO3H 的可逆光致異構(gòu)化。
表面張力測(cè)量證實(shí)了偶氮SO3H的兩親性，發(fā)現(xiàn)光異構(gòu)化對(duì)偶氮SO3H的疏水性有很大影響，z -異構(gòu)體比e -異構(gòu)體更容易溶于水相。作者測(cè)試了細(xì)胞是否能從溶液中捕獲并部分去除偶氮SO3H。在可見(jiàn)光照射后，通過(guò)吸收光譜測(cè)量上清液中光開(kāi)關(guān)的濃度，發(fā)現(xiàn)更多的z -異構(gòu)體仍在水相中。這些實(shí)驗(yàn)有力地證明了疏水的e -異構(gòu)體確實(shí)比親水的z -異構(gòu)體更傾向于嵌入紅細(xì)胞的質(zhì)膜。為了觀察偶氮SO3H對(duì)紅細(xì)胞膜和細(xì)胞整體形態(tài)的影響，將紅細(xì)胞小心地加入到偶氮SO3H的DMEM溶液中(c = 1.0 mM，即低于臨界膠束濃度)。最初，幾乎所有的細(xì)胞都呈圓齒狀(見(jiàn)圖2a)。這是因?yàn)楣忾_(kāi)關(guān)處于熱力學(xué)靜止?fàn)顟B(tài)(e -異構(gòu)體)，并立即插入紅細(xì)胞的質(zhì)膜，從而增加了膜面積。觀察幾個(gè)小時(shí)，未發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞的形態(tài)有任何變化。然而，在紫外光(365 nm)照射下，觀察到非常快速和明顯的形狀變化。紅細(xì)胞在不到2s的時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)椴灰?guī)則輪廓的盤狀細(xì)胞形狀(見(jiàn)圖2b, c)。偶氮SO3H的e -異構(gòu)體插入到紅細(xì)胞質(zhì)膜的外半小葉中，導(dǎo)致膜面積增加，從而改變紅細(xì)胞(棘細(xì)胞)的表面積與體積比。一旦分子開(kāi)關(guān)被光異構(gòu)化為z型異構(gòu)體，與脂質(zhì)雙分子層結(jié)合的偶氮SO3H顯著減少(~40%)。光異構(gòu)回e -異構(gòu)體(490 nm)，偶氮SO3H重新結(jié)合到紅細(xì)胞表面，因此可以再次觀察到棘細(xì)胞(圖2c)。為了量化可見(jiàn)變化，作者計(jì)算了盤狀細(xì)胞和棘細(xì)胞形式的自由漂浮紅細(xì)胞圖像的像素值的標(biāo)準(zhǔn)差，作為紅細(xì)胞圖像結(jié)構(gòu)均勻性的衡量標(biāo)準(zhǔn)。觀察到兩個(gè)階段之間的顯著差異(見(jiàn)圖2e)。
圖2 自由漂浮的紅細(xì)胞的顯微鏡圖像。
為量化光開(kāi)關(guān)對(duì)紅細(xì)胞力學(xué)的影響，作者對(duì)紅細(xì)胞進(jìn)行了微移液管抽吸。圖3a顯示部分抽吸的紅細(xì)胞。紅色虛線表示舌在初始狀態(tài)下的位置，如圖3a頂部面板所示。偶氮SO3H的e -異構(gòu)體嵌入紅細(xì)胞質(zhì)膜中，增加外半小體的膜面積。在紫外線照射下，偶氮SO3H的e -異構(gòu)體傾向于離開(kāi)雙分子層，與初始狀態(tài)相比，表面積減小。圖3b中描述了多次周期實(shí)驗(yàn)中舌頭在移液器內(nèi)隨時(shí)間的跟蹤位置。顯示了響應(yīng)偶氮SO3H光異構(gòu)的細(xì)胞膜在微移液管內(nèi)外的快速和可逆的運(yùn)動(dòng)。
圖3 分析具有約低施加張力的抽吸紅細(xì)胞。
在圖3c中，10個(gè)周期的時(shí)間相關(guān)運(yùn)動(dòng)繪制為紅點(diǎn)，黑色曲線分別是紫外線和可見(jiàn)光的指數(shù)擬合。在紫外線(tUV)照射后，舌立即顯示出大而快速的移液器運(yùn)動(dòng)。tUV = 240±70 ms開(kāi)關(guān)可以達(dá)到平臺(tái)?？梢?jiàn)光開(kāi)關(guān)的弛豫時(shí)間要慢兩倍，為tvis = 490±110 ms(圖3e)。很可能快速的光異構(gòu)化(~10?12 s)本身并不是決定速率的步驟。因此，膜伸展和膜收縮要么發(fā)生在不同的時(shí)間尺度上，要么偶氮-SO3H從質(zhì)膜上脫離的速度快于插入的速度?？梢?jiàn)光照射時(shí)，膜表現(xiàn)出更強(qiáng)的波動(dòng)，然后延伸到移液器中。相反，當(dāng)紫外線照射時(shí)，膜波動(dòng)沒(méi)有增加。圖3還顯示了微移液器實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析的總結(jié)結(jié)果。紅細(xì)胞平均表面積變化如圖3d所示。平均絕對(duì)面積變化為2.9±1.2μm2，相對(duì)表面積變化為2.1±0.9%。作者通過(guò)微移管實(shí)驗(yàn)研究光異構(gòu)化速率是否改變弛化時(shí)間，在多次循環(huán)中逐漸增加可見(jiàn)光照射強(qiáng)度，同時(shí)保持紫外線照射不變，以始終回到PSSE→Z。此外，還進(jìn)行了紫外光強(qiáng)度增加而可見(jiàn)光強(qiáng)度保持不變的反向?qū)嶒?yàn)。圖4可以看出，在低可見(jiàn)光強(qiáng)度下，tvis較高，并隨著可見(jiàn)光強(qiáng)度的增加而降低。此外，在一定的可見(jiàn)光強(qiáng)度下，弛豫時(shí)間達(dá)到一個(gè)與恒定可見(jiàn)光強(qiáng)度下的循環(huán)實(shí)驗(yàn)相似的tvis的高原值（圖4a）。隨著紫外線強(qiáng)度的增加，也可以觀察到相同的趨勢(shì)（圖4b）。表明在較低的照射強(qiáng)度下，完全光異構(gòu)化的速度會(huì)減慢，因此弛豫時(shí)間較長(zhǎng)。但在一定強(qiáng)度下，弛豫時(shí)間不再因光異構(gòu)化速度加快而加快，其他效應(yīng)也限制了弛豫速率。高光照強(qiáng)度下tUV和tvis兩個(gè)時(shí)間之間的速率差異可能是由于偶氮-SO3H從周圍的水?dāng)U散到膜中和從膜中擴(kuò)散出來(lái)之間的不對(duì)稱性造成的。
圖4 吸出的紅細(xì)胞的弛豫時(shí)間取決于光強(qiáng)度。
對(duì)自由浮動(dòng)紅細(xì)胞的分析也顯示了弛豫時(shí)間對(duì)輻照強(qiáng)度的依賴性，可見(jiàn)開(kāi)關(guān)也比紫外開(kāi)關(guān)慢。因此，弛豫時(shí)間的差異是由偶氮SO3H從質(zhì)膜上插入或脫離引起的。根據(jù)偶氮苯(Azo-SO3H)的光異構(gòu)化，它要么大部分自由溶解在介質(zhì)中(左z型異構(gòu)體)，要么嵌入到紅細(xì)胞的質(zhì)膜中(右e型異構(gòu)體)
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