為大家分享一篇發(fā)表在Science上的文章，文章的題目是“Continuous evolution of compact protein degradation tags regulated by selective molecular glues”，文章的通訊作者是來自Harvard MIT Broad Institute的David R. Liu、Amit Choudhary，主要開展基因編輯相關(guān)的研究；以及來自Dana-Farber癌癥研究院的Eric S. Fischer，主要進(jìn)行結(jié)構(gòu)生物學(xué)和泛素酶體相關(guān)的研究。
分子膠是一種小分子誘導(dǎo)蛋白靶向降解技術(shù)，例如沙利度胺及其類似物代表的免疫調(diào)節(jié)藥物（IMiDs）可以結(jié)合CRBN，從而招募CRL4CRBN E3泛素連接酶。IMiDs結(jié)合的CRBN識別鋅指（ZF）轉(zhuǎn)錄因子中的β轉(zhuǎn)角（β-turn）motif，因此將β-turn motif（通常稱為degron）融合在其他蛋白上即可實(shí)現(xiàn)靶向降解。但當(dāng)前IMiDs具有一定的脫靶效應(yīng)，限制了其進(jìn)一步發(fā)展。理想的degron應(yīng)當(dāng)具有序列短小、可被細(xì)胞通透性好的小分子識別、無脫靶響應(yīng)等特點(diǎn)。因此在本文中作者開發(fā)了一種噬菌體輔助的連續(xù)進(jìn)化系統(tǒng)（PACE），用于得到小的ZF motif，重新編程分子膠復(fù)合物。用于篩選的M13噬菌體包含3個(gè)質(zhì)粒，SP（selection phage）包含使用待進(jìn)化基因替換噬菌體外殼蛋白pIII基因gIII的噬菌體全套基因，AP（accessory plasmid）用于當(dāng)分子膠存在活性時(shí)提供pIII，MP（mutagenesis plasmid）包含提高SP突變概率的一系列蛋白。選擇壓力為連續(xù)（PACE）或者定期（PANCE）加入新鮮宿主細(xì)胞稀釋。在雙雜交系統(tǒng)中，作者首先構(gòu)建了一個(gè)驗(yàn)證系統(tǒng)：FKBP12被融合在DNA結(jié)合蛋白RR69，錨定在啟動子pLac*的上游，當(dāng)Rapamycin加入后招募FBP形成二聚系統(tǒng)，F(xiàn)BP則與大腸桿菌RNA聚合酶RNAP的小ω亞基融合，RNAP被招募到pLac*從而驅(qū)動下游gIII或熒光素酶報(bào)告基因luxAB的表達(dá)。初步結(jié)果顯示rapamycin加入1小時(shí)后產(chǎn)生明顯報(bào)告信號，表明該系統(tǒng)可行。因此作者隨后基于此構(gòu)建了分子膠和待進(jìn)化蛋白的篩選雙雜交系統(tǒng)。
作者隨后選擇了合適的IMiD分子用于篩選，作者團(tuán)隊(duì)近期合成了一系列使用鄰苯二甲酰亞胺取代的IMiDs，在其中作者選擇了PT-179作為潛在的候選物。作者首先通過無偏的蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組評估了PT-179的脫靶效應(yīng)，結(jié)果顯示PT-179處理后僅有3個(gè)表達(dá)差異的基因，具有非常少的內(nèi)源性底物。作者隨后將PT-179用于MG-PACE回路篩選。作為起始ZF，作者選擇了一個(gè)由IMiD底物IKZF1和ZFP91組成的60AA嵌合體，稱為SD0。在CRBN部分，作者首先使用CRBN CTD用于前期篩選，這是由于作者發(fā)現(xiàn)全長CRBN在大腸桿菌中的表達(dá)受到了限制。通過前期篩選作者初步篩選到了SD8序列，隨后作者將其進(jìn)一步送入全長CRBN的PANCE中篩選，并換用結(jié)合力稍弱的PK-1016替代PT-179，用于提高選擇的嚴(yán)格性，借此作者得到了SD35。為了排除PK-1016不依賴CRBN的情況，作者最后設(shè)計(jì)了負(fù)選擇系統(tǒng)，將gIII-negtive基因作為報(bào)告基因，并最終得到了SD36。得到SD36后作者隨后在活細(xì)胞中進(jìn)行了驗(yàn)證，同時(shí)考慮到SD36的突變發(fā)生在degron的中心，因此作者截?cái)嗔薙D36的N端和C端得到了“最小”的degron——SD40。作者還使用雙引物編輯twinPE將SD40敲入293T細(xì)胞內(nèi)源PLK1中，實(shí)現(xiàn)顯著的PLK1敲低效果。最后作者還將該系統(tǒng)進(jìn)一步用于篩選小鼠CRBN的degron，并最終得到了SD56變體。綜上所述，在本文中作者使用噬菌體輔助的連續(xù)進(jìn)化系統(tǒng)，篩選了脫靶效應(yīng)更低的IMiD PT-179的degron，為分子膠領(lǐng)域提供了新的工具。原文鏈接：https://www.science.org/doi/10.1126/science.adk4422原文引用：10.1126/science.adk4422
