生物膜不僅將細胞和細胞器從周圍環(huán)境中分離出來，而且控制著細胞的各種功能，包括細胞形態(tài)形成、動力、物質(zhì)交換和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。最近的研究強調(diào)了脂質(zhì)組織和膜蛋白對膜功能的重要性。脂質(zhì)功能的機制在臨床應(yīng)用中也引起了廣泛關(guān)注，因為與脂質(zhì)生物合成相關(guān)的基因缺陷可能導(dǎo)致遺傳性疾病 脂代謝的明顯改變促進了癌細胞的生長和腫瘤的發(fā)生。
在這項研究中，作者介紹了一種溶劑致色性熒光細胞膜探針，具有光穩(wěn)定性和低毒性，可實現(xiàn)長時間（>60min）的連續(xù)觀察。在分子設(shè)計中，引入了不與細胞組織發(fā)生反應(yīng)的芳香酯，確保化學(xué)穩(wěn)定性和非侵入性。芳香酯的光穩(wěn)定性可以通過使用能級圖等光物理過程解釋，類似于Prodan衍生物的方法。此外，作者已探索了通過微調(diào)其π-系統(tǒng)來抑制和操縱亞系統(tǒng)交叉和光降解的策略。
圖1 溶劑致色性膜探針的研發(fā)和分子設(shè)計概念。a）溶劑致色性膜探針的歷史發(fā)展。b）分子設(shè)計的概念圖。黑色元素是光化學(xué)所需的，而紅色元素是生物學(xué)所需的。
光物理特性
作者研究了新合成染料的光物理性質(zhì)，如圖2a所示。除了Prodan（芴和芘）和酮衍生物中使用的酯衍生物外，作者考慮了在分子的長軸方向上延伸π共軛的芴骨架，以增加偶極矩。酯衍生物的光物理性質(zhì)與具有相同π電子骨架的乙酰/甲酰衍生物相當(dāng)，并通過修改，創(chuàng)造了發(fā)射范圍各異的強發(fā)光染料。在這些染料中，FCM、FπCMo-F、PCM、PCMst、FπCMst和FstCM的光物理性質(zhì)優(yōu)異，等同或超過了Prodan的性能。FstCMo-F發(fā)出約700nm的紅光，并有望成為細胞膜探針。
圖2 光譜特性?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)，吸收（虛線）和熒光（實線）光譜如下：a) FπCM, b) FπCMo-F, c) FπA, d) FCM, e) FR0, f) FstCMo-F, g) PCM, h) PCMst, i) PK, j) FπCMst 和 k) FstCM。藍色網(wǎng)格區(qū)域表示Prodan的熒光范圍。l) 對于FπCM，在固體晶體和非晶態(tài)狀態(tài)的熒光光譜以及FπCM的單晶裝填結(jié)構(gòu)?；疑咨?，紅色和藍色球分別代表C，H，O和N。
光穩(wěn)定性
作者通過在低極性溶劑（模型）中測量連續(xù)光照下存在氧氣的光降解曲線以及在活細胞環(huán)境下評估了溶劑致色變?nèi)玖系墓夥€(wěn)定性。光穩(wěn)定性在顯微觀察條件、觀察對象和染料性質(zhì)方面有很大差異。因此，并不適用于所有染料的標(biāo)準(zhǔn)評估方法。為了解決這個問題，作者選擇甲苯作為溶劑進行測量，因為它的極性類似于細胞膜。FπCM、PK和Prodan的光降解曲線如圖3a、b所示。所有酯化合物在經(jīng)過3小時后仍保持超過94%的初始熒光強度，相比之下，它們的光穩(wěn)定性要優(yōu)于PK（86%）、Prodan（20%）和NR（76%），這些化合物通常用于需要高光穩(wěn)定性的STED顯微鏡技術(shù)。
圖3 a) FπCM、PK和Prodan在甲苯中氧氣下的光降解曲線。激發(fā)波長（λex）為375 nm。b) 在甲苯中氧氣下光照3小時后與初始熒光強度的熒光強度比較。A：FπCM，B：FstCMo-F，C：PK，D：Prodan，E：NR。c) 顯示用FπCM染色的GUVs中的Ld和Lo相的共聚焦熒光圖像。GUVs由DOPC（Ld）和DSPC/Cho（Lo）組成。d)模型膜中液態(tài)無序（Ld）和液態(tài)有序（Lo）相的示意圖。還顯示了發(fā)出不同波長熒光的染料。e) 用FπCM染色的EpH4的共聚焦圖像。f)在細胞膜中隨時間變化的FπCM、PK和Laurdan的光降解曲線。g) FπCM、Laurdan和PK在細胞膜中連續(xù)光照下的時間點成像。
接下來，作者檢查FπCM是否能夠檢測模型膜和活細胞中的膜秩序。作為生物膜的模型，巨大單層囊泡（GUVs）被用FπCM染色，以評估其區(qū)分液態(tài)有序（Ld）和液態(tài)無序（Lo）相的能力，使用共聚焦顯微鏡。與在不同極性溶劑中的光譜性質(zhì)一致（圖2a），由DOPC組成的Ld相囊泡顯示高的紅色（>500 nm）/藍色（<500 nm）比率，而由DSPC/Chol組成的Lo相囊泡顯示低比率（圖3c和3d）?；罴毎麅?nèi)的膜秩序異質(zhì)性如圖3e所示，FπCM顯示出EpH4小鼠上皮細胞、L-929和NIH3T3小鼠成纖維細胞以及人源HeLa細胞中飽和脂質(zhì)、鞘脂質(zhì)和膽固醇豐富的細胞表面質(zhì)膜與富含不飽和脂質(zhì)的內(nèi)部細胞器之間的明顯秩序差異（圖4a），表明FπCM可以檢測到無論細胞系還是宿主物種，細胞的膜異質(zhì)性。這些結(jié)果表明，正如早期對PK所顯示的那樣，FπCM可以揭示細胞膜的秩序異質(zhì)性。
圖4 a) 上面，用1μM FπCM + 100nm NileRed或1μM PK染色的活HeLa細胞。紅/藍比和信號強度如圖3c所示。下面，FπCM明亮顆粒與脂滴（NileRed）的共定位。b、c)在活細胞中同時觀察溶劑致色性染料和熒光蛋白：b) 比較FπCM和PK對HeLa細胞分裂進程的影響。染色體形態(tài)與mCherry結(jié)合的H2B同時觀察。c) 對間期細胞形態(tài)影響的比較。
因此，作者在活細胞的生理條件下比較了FπCM、PK和Laurdan的光穩(wěn)定性。圖3f展示了在EpH4細胞中連續(xù)光照射期間FπCM、PK和Laurdan的光降解曲線。與在甲苯溶劑中的光降解曲線相比，PK在測量開始時失去了大部分熒光。這可能除了光降解外，與活細胞中底物反應(yīng)導(dǎo)致的熒光單元修飾有關(guān)。Laurdan和PK分別僅保持了約30%和10%的初始熒光強度，而FπCM保持了約80%。表明FπCM對各種設(shè)備的激光光強具有抵抗力。
生物成像應(yīng)用
作者研究了光穩(wěn)定膜探針FπCM相對于PK在活細胞時間序列觀察中的優(yōu)勢（圖4）。FπCM和PK都顯示出HeLa細胞膜的有序異質(zhì)性（圖4a
