分享一篇發(fā)表在Nature Methods雜志上的文章，題目為“Post-translational modification-centric base editor screens to assess phosphorylation site functionality in high throughput”。文章的通訊作者是來(lái)自拉霍亞免疫學(xué)研究所的Samuel A. Myers教授，他們課題組的主要研究方向是利用基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究免疫細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制。
磷酸化是目前研究最透徹的翻譯后修飾之一。利用基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，我們可以對(duì)不同生理病理?xiàng)l件下細(xì)胞中磷酸化修飾位點(diǎn)的變化進(jìn)行高通量大規(guī)模的解析，但是很難去分析這些磷酸化位點(diǎn)的功能。在已知的磷酸化位點(diǎn)中，僅有不到3%的位點(diǎn)有功能的注釋。大量的磷酸化位點(diǎn)功能未知，像一個(gè)有待探索的寶庫(kù)，蘊(yùn)含無(wú)限可能。在本文中，作者希望可以利用單堿基突變的方法對(duì)細(xì)胞中磷酸化位點(diǎn)的功能進(jìn)行高通量分析。
首先，作者要建立在目標(biāo)細(xì)胞模型中高覆蓋的磷酸化位點(diǎn)數(shù)據(jù)集。作者選取的是他們實(shí)驗(yàn)室比較熟悉的T細(xì)胞活化模型，利用CD3和CD28抗體對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行處理來(lái)活化T細(xì)胞，取0, 3, 9 和 27分鐘處理的樣品進(jìn)行磷酸化蛋白質(zhì)組的定量分析，最終定量到了26,037個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中899個(gè)位點(diǎn)在T細(xì)胞激活過程中發(fā)生了顯著變化。作者對(duì)定量到的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行了嚴(yán)格的過濾，選取了大約19,000個(gè)位點(diǎn)，擬利用堿基編輯技術(shù)對(duì)這些修飾位點(diǎn)進(jìn)行單堿基的突變。在此，作者并沒有只選擇有變化的899個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行突變研究，作者給出的解釋是：一些有功能的磷酸化位點(diǎn)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上可能不具有顯著的變化。作者發(fā)現(xiàn)在目標(biāo)位點(diǎn)數(shù)據(jù)集中，有7,618個(gè)位點(diǎn)可以被基于ABE8e編輯器的sgRNA靶向，發(fā)生A-G的突變，有7,063個(gè)位點(diǎn)可以被基于BE4編輯器的sgRNA靶向，發(fā)生C-T的突變。作者一共構(gòu)建了接近10000個(gè)單點(diǎn)突變的細(xì)胞庫(kù)，并對(duì)位點(diǎn)突變后細(xì)胞的存活及增殖能力進(jìn)行了評(píng)價(jià)。同時(shí)，作者給細(xì)胞加上了NFAT, NFκB 和AP1轉(zhuǎn)錄反應(yīng)原件，用來(lái)檢測(cè)突變細(xì)胞中這三個(gè)通路的水平。最終，作者發(fā)現(xiàn)PHLPP1蛋白S118P突變能夠顯著降低活化T細(xì)胞核因子（NFAT）的水平，這是首次報(bào)道PHLPP1對(duì)于NFAT活性的正向調(diào)控作用。總而言之，本文利用單堿基編輯技術(shù)對(duì)細(xì)胞中磷酸化位點(diǎn)的功能進(jìn)行了大規(guī)模的分析。這個(gè)模式對(duì)于不同的翻譯后修飾、不同的細(xì)胞種類以及不同的生物學(xué)過程都具有較好的普適性，能夠廣泛應(yīng)用于翻譯后修飾在不同生理病理?xiàng)l件下的高通量分析。文章鏈接：https://www.nature.com/articles/s41592-024-02256-z原文引用：DOI：10.1038/s41592-024-02256-z
