分享一篇最近發(fā)表在 Science 上的文章，本文的題目是“Repair of CRISPR-guided RNA breaks enables site-specific RNA excision in human cells”。本文的核心是作者們發(fā)現(xiàn)可以利用嗜熱鏈球菌的 Type III CRISPR 復(fù)合物，在人類細(xì)胞中的 RNA 上實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異的切除。本文的通訊作者是來自美國蒙大拿州立大學(xué)的 Artem Nemudryi 和 Blake Wiedenheft。
CRISPR 基因組編輯技術(shù)已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用到了生命科學(xué)等領(lǐng)域，這一技術(shù)對于基因突變所導(dǎo)致的疾病的治療具有極為重要的意義。第一代 CRISPR 基因編輯技術(shù)，基于 Cas9 核酸內(nèi)切酶在基因組上產(chǎn)生雙鏈斷裂，細(xì)胞隨即對斷裂的位點(diǎn)進(jìn)行修復(fù)，但是細(xì)胞在進(jìn)行修復(fù)的時(shí)候，往往具有很大的不確定性，比如會產(chǎn)生不確定數(shù)目堿基（甚至大片段）的插入和缺失等。因此，相比于直接在基因組上進(jìn)行編輯，對 RNA 進(jìn)行編輯是一種更為安全的方式。Type VI CRISPR 介導(dǎo)的核糖核酸內(nèi)切酶 Cas13 被用于 RNA 的敲低，但是，Cas13 本身具有的核酸酶活性也會造成 non-targeting RNA 的降解。與 Cas13 不同，Type III 復(fù)合體可以精確地實(shí)現(xiàn) RNA 上 6 的倍數(shù)的核苷酸切除。因此，作者們由此想到，可以利用這一點(diǎn)，來實(shí)現(xiàn) RNA 上位點(diǎn)特異性的核苷酸切除。作者們直接在 HEK-293T 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了 SthCsm 復(fù)合物，靶向 PARK7 RNA 中的某一個(gè)區(qū)域，作者用 amplicon sequencing 確定了靶向區(qū)域的確出現(xiàn)了 6 倍數(shù)的堿基的切除。隨后，作者們想到 SthCsm 切除 RNA 后，會產(chǎn)生一個(gè) 2’,3’-cyclic phosphate 和 5’-OH，而哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的 RNA 連接酶 RTCB 能夠發(fā)揮連接這兩個(gè)末端的功能，于是，作者們在細(xì)胞中敲除了 RTCB 后，發(fā)現(xiàn)靶向區(qū)域被修復(fù)的比例明顯地降低了。根據(jù) ClinVar 數(shù)據(jù)庫的記錄，我們基因組中大概有 4 萬個(gè) nonsense 突變（包括終止密碼子），比如 CFTR W1282X 突變體會導(dǎo)致其 RNA 含量降低，導(dǎo)致蛋白合成不足，最終發(fā)展成為囊性纖維化。作者們設(shè)想，可以利用 SthCsm 實(shí)現(xiàn) W1282X 位點(diǎn)特異性的切除，從而維持 CFTR RNA 的穩(wěn)定性。作者們用內(nèi)源攜帶 CFTR W1282X 的永生化細(xì)胞株進(jìn)行 SthCsm RNA 編輯，發(fā)現(xiàn)盡管 SthCsm 會降低 RNA 的數(shù)量，但是能夠產(chǎn)生編輯的 RNA，從而 by-pass W1282X 所造成的 nonsense 突變。總之，本文探究了 SthCsm 在 RNA 上位點(diǎn)特異性的編輯能力，并且提出它對于未來基因治療具有借鑒意義。原文鏈接：https://www.science.org/doi/10.1126/science.adk5518文章引用：10.1126/science.adk5518
