分享一篇近期發(fā)表在JACS上的研究進(jìn)展，題為：A Method for Rigorously Selective Capture and Simultaneous Fluorescent Labeling of N?Terminal Glycine Peptides。該工作的通訊作者是來自德克薩斯大學(xué)奧斯汀分校的Eric V. Anslyn。
對多肽或蛋白的氨基酸側(cè)鏈或N端與C端的選擇性標(biāo)記是位點(diǎn)特異性生物偶聯(lián)的核心內(nèi)容，但現(xiàn)有偶聯(lián)方法難以區(qū)分N端不同氨基酸殘基的伯氨基。本文中，作者將研究聚焦在多肽N端甘氨酸（Gly）殘基的選擇性標(biāo)記。在生物體內(nèi)，N端Gly是一種蛋白酶體的降解靶點(diǎn)，用于清除細(xì)胞凋亡過程中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）切割產(chǎn)生的多肽片段。此外，甘氨酸的修飾在合成高分子中也較為常見。因此，發(fā)展選擇性N端Gly標(biāo)記方法對多肽/蛋白和甘氨酸修飾材料的功能化至關(guān)重要。 Gly和其他氨基酸的區(qū)別是沒有取代基，因此作者設(shè)想能否尋找合適的反應(yīng)將Gly的亞甲基“雙活化”，形成2根新的化學(xué)鍵，而其他氨基酸則因側(cè)基的存在無法反應(yīng)，最終實(shí)現(xiàn)對N端Gly的高選擇性。那么，什么樣的反應(yīng)能“雙活化”Gly的亞甲基呢？受胺與1,3-二酮的吡咯合成反應(yīng)的啟發(fā)，作者提出Gly可以和1,3-二酮發(fā)生如圖1所示的多步反應(yīng)，最終形成一個穩(wěn)定的吡咯產(chǎn)物。 2,5-二苯基吡咯是一種已知的熒光基團(tuán)，因此作者首先研究了二苯甲?；淄椋?/span>DBM-1）和甘氨酸甲酰胺（GMA）的模型小分子反應(yīng)（圖2）。篩選后的最佳反應(yīng)條件為DMF溶劑130 ℃微波反應(yīng)器反應(yīng)5 h。最終作者成功以21%的產(chǎn)率分離得到了目標(biāo)產(chǎn)物PY，并確證了它的結(jié)構(gòu)。 在上述小分子模型反應(yīng)的基礎(chǔ)上，作者隨后開展了多肽的標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。他們合成了六肽H2N-GAAYAA作為模型底物與DBM-1反應(yīng)，其中Y（酪氨酸）的作用是為多肽提供UV信號便于HPLC分析（圖3）。LC-MS和光譜表征支持成功得到了預(yù)期的Py-(G)AAYAA產(chǎn)物，修飾率為63%。圖3. 模型小肽的反應(yīng)。（a）反應(yīng)式；（b）底物H2N-GAAYAA的吸收光譜；（c）產(chǎn)物Py-(G)AAYAA的吸收光譜；（d）275 nm紫外光作用下的發(fā)射光譜；（e）底物和產(chǎn)物在254 nm下的照片。 接下來，作者檢驗(yàn)了上述標(biāo)記方法對多肽鏈上其他氨基酸殘基的兼容性，包括Lys(K)、Ser(S)、Gln(Q)、Glu(E)、Asp(D)、Met(M)和Cys(C)等（圖4）。他們發(fā)現(xiàn)，除Cys外，其他氨基酸都是兼容的，而Cys用碘乙酰胺保護(hù)后也可兼容。其他氨基酸的α位伯胺和Lys側(cè)基的伯胺在修飾過程中會轉(zhuǎn)變?yōu)閬啺?，但在酸性條件下可以將亞胺水解回到伯胺而不影響吡咯結(jié)構(gòu)。即便Gly的相鄰殘基為大位阻的Tyr(Y)或Trp(W)也不會顯著降低修飾效率。 最后，作者驗(yàn)證了上述方法在多肽混合物中選擇性標(biāo)記N端Gly多肽的能力（圖5）。他們在DBM-1結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上引入了TMS保護(hù)的炔基，以便于標(biāo)記多肽的后續(xù)點(diǎn)擊反應(yīng)。然后，將大過量的DBM-2加入N端分別為G、F、V、W、L和Y的多肽的混合溶液中，按原條件反應(yīng)。反應(yīng)混合物在酸性水解后，僅N端Gly多肽被成功標(biāo)記。為了將標(biāo)記多肽從混合物中分離出來，作者選擇加入疊氮修飾的樹脂借助CuAAC反應(yīng)將含炔的肽捕獲。最終，將樹脂上的肽切下，僅得到N端標(biāo)記了吡咯的產(chǎn)物，證明了該方法對復(fù)雜混合物的分析能力。圖5. DBM-2對多肽混合物的選擇性標(biāo)記 綜上，作者基于N端甘氨酸與1,3-二酮的吡咯生成反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了對復(fù)雜多肽混合物中含N端甘氨酸的多肽的選擇性標(biāo)記。 最后，我們將此方法與另外兩種N端Gly選擇性修飾方法做一個比較（圖6）。Rai法（Nat. Commun. 2019, 10, 2539）和Kanemoto法（Angew. Chem., Int. Ed. 2024, 63, e202320012）的實(shí)現(xiàn)依賴于Gly較小的位阻帶來的速率優(yōu)勢，因此延長反應(yīng)時間可能會導(dǎo)致選擇性的降低，而Anslyn法（本文）則是基于Gly的“雙活化”策略，因此其他氨基酸無法轉(zhuǎn)化為預(yù)期吡咯結(jié)構(gòu)，具有高度的選擇性。此外，三種方法的修飾效率和產(chǎn)物結(jié)構(gòu)也各不相同，前兩種轉(zhuǎn)化率較高，在修飾后仍保留了胺的結(jié)構(gòu)，便于后續(xù)其他修飾反；而Anslyn法雖轉(zhuǎn)化率略低且反應(yīng)條件劇烈，但一步到位將伯胺轉(zhuǎn)化為了吡咯熒光基團(tuán)，在多肽分析方面有著巨大的應(yīng)用潛力。三種方法各有優(yōu)劣，適用場景也各不相同，都是多肽選擇性修飾的有益探索。
