推薦一篇發(fā)表在Nature Chemical Biology上的文章，文章的題目是: Imaging the dynamics of messenger RNA with a bright and stable green fluorescent RNA。通訊作者是華東理工大學的楊弋教授，朱麟勇教授和陳顯軍教授。楊弋教授課題組的研究對象為利用合成生物技術和光遺傳學技術控制和檢測細胞內分子過程的前沿技術，朱麟勇教授課題組的研究聚焦于光化學與生物醫(yī)用材料，陳顯軍教授的研究方向是針對DNA，RNA，蛋白質等生物分子的光遺傳學檢測與控制技術。
綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein, GFP）是生物化學和細胞生物學中研究最廣泛、應用最廣泛的熒光蛋白之一，GFP具有固定的熒光特性，成熟快速且安全，對融合蛋白具有良好的耐受性，并且在常規(guī)熒光儀器上使用標準濾光片可以方便地可視化。因此，GFP在研究蛋白動力學和功能方面具有很大的用途，而且在活細胞和活體中檢測離子、代謝物信使和蛋白質相互作用也有應用。在熒光RNA方面，同樣綠色熒光蛋白與標準的綠色熒光蛋白濾光片的光譜擬合對細胞RNA的單色或多色成像特別有用。研究者于2019年在Nature Biotechnology上報道一種類似GFP的合成染料HBC，與熒光RNA適配體Pepper，Pepper可以特異性結合并激活HBC530發(fā)出強烈的綠色熒光，比之前存在的綠色熒光提高了一個數(shù)量級，但其光穩(wěn)定性有限。本研究的目的是開發(fā)出亮度更強，光穩(wěn)定性更好的綠色熒光RNA。
作者首先合成了一種非GFP樣熒光團，稱為ACE (3-(2,3,6,7-tetrahydro-1H,5H-pyrido(3,2,1-ij)quinolin-9-yl)acrylamide-2-cyano-N-(2-(2-aminoethoxy) ethyl))，在溶液中具有低熒光，與HBC530相比，ACE的電子給體被兩個哌啶環(huán)鎖住以抵抗旋轉能量消耗，從而提高了熒光團的熒光效率。此外，電子供體的剛性共面結構使其更容易通過π -π相互作用被RNA結構中的凸起基序牢牢鎖定。此外，含有聚乙二醇與氨基酸連接的電子受體可以為氫鍵提供給體和受體，這兩者都可以促進熒光團與RNA的相互作用。熒光團-RNA親和力的提高可能有助于抑制熒光團18的光異構化。因此，我們認為ACE將是開發(fā)具有高細胞亮度和光穩(wěn)定性的新型熒光RNA的絕佳候選者，并且RNA適配體結合的熒光團的光漂白最小。為選擇與ACE結合的適配體，作者采用指數(shù)富集（SELEX）方法對配體進行系統(tǒng)進化，經(jīng)過7輪SELEX后，洗脫的RNA文庫顯示，相對于原始RNA文庫，ACE的熒光激活顯著增強。對編碼RNA適體的互補DNA (cDNA)進行測序，在這些適體中，其中一個適體A2表現(xiàn)出超過400倍的ACE熒光增強。接著作者對A2進行結構改造，對A2-T2截斷，并對A2-T2進行單一和組合突變，最終篩選出C2A/C12U雙突變表達A2-T2的HEK293T細胞在ACE孵育下亮度最高，作者將其命名為“Okra”。Okra-ACE的激發(fā)最大值在468 nm，發(fā)射最大值在505 nm，因此作者將這種RNA-熒光團復合物命名為“Okra505”。作者比較了Okra-ACE與其它熒光RNA熒光強度和熒光穩(wěn)定性的差別，結果表明，Okra-ACE的整體背景熒光非常弱，熒光強度最佳，且具有很好的光穩(wěn)定性。mRNA的亞細胞定位可以為原核和真核細胞中基因表達的精確時空控制提供了一種機制，為了測試Okra是否可以檢測活細胞中的mRNA，作者在T7啟動子控制的大腸桿菌中表達帶有F30-Okra標記的3‘非編碼區(qū)mCherry mRNA，經(jīng)IPTG誘導后，可觀察到綠色和紅色熒光，且綠色熒光強度高于mCherry-F30-Pepper和mCherry-F30-Broccoli的1.7倍和6.9倍，凸顯了Okra亮度的大幅增強。接著，作者使用Okra505檢測哺乳動物細胞中RNA聚合酶II轉錄的mRNA，實現(xiàn)了Okra505在活細胞水平的標記。綜上，作者開發(fā)了綠色熒光RNA，具有熒光強度更好，穩(wěn)定性更佳的優(yōu)勢，可以實現(xiàn)在活菌和活細胞中的標記，將為研究RNA動力學和亞細胞定位提供幫助。原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41587-019-0249-1文章引用：DOI：10.1038/s41587-019-0249-1
