分享一篇ACS Central Science上的文章：A Translation-Independent Directed Evolution Strategy to Engineer Aminoacyl-tRNA Synthetases，通訊作者是波士頓學(xué)院的Abhishek Chatterjee教授，他們課題組主要開發(fā)非天然氨基酸插入技術(shù)用于新型生物療法。本文作者開發(fā)了名為START的策略，實(shí)現(xiàn)了無需表達(dá)蛋白即可篩選指定非天然氨基酸的氨酰tRNA合成酶(aaRS)。
非天然氨基酸插入技術(shù)為精確調(diào)控蛋白功能開拓了全新的化學(xué)空間，在非天然氨基酸插入體系的篩選過程中，目前的難點(diǎn)在于有一些非天然氨基酸難以被天然的核糖體接納。雖然可以通過編輯核糖體蛋白的方式來實(shí)現(xiàn)插入，但是如果要對(duì)aaRS和核糖體一起篩選將會(huì)引入巨大的工作量。如果能夠首先定向進(jìn)化可用的aaRS，再對(duì)核糖體進(jìn)行編輯將會(huì)大幅簡(jiǎn)化這一過程，因此本文作者希望開發(fā)一種無需經(jīng)過后續(xù)的核糖體翻譯過程即可對(duì)aaRS進(jìn)行定向進(jìn)化，使其對(duì)特定的非天然氨基酸進(jìn)行識(shí)別的方法。作者的策略是對(duì)氨酰tRNA使用高碘酸進(jìn)行處理，由于沒有連接?；膖RNA會(huì)被氧化為鄰二醛，因此只有成功連接了酰基的tRNA能夠保留3’-OH。在對(duì)酰基進(jìn)行堿性水解后，含有3‘-OH的tRNA可以與后續(xù)加入的寡核苷酸序列進(jìn)行配對(duì)并被進(jìn)一步延伸，這部分被成功延伸的tRNA可以通過非變性膠上的位移來與未延伸的tRNA進(jìn)行區(qū)分，再用于后續(xù)的測(cè)序。為了能夠在測(cè)序之后確定有活性的aaRS攜帶了哪種突變，作者在tRNA的反義密碼子區(qū)域引入了10個(gè)隨機(jī)的堿基序列作為條形碼，這些條形碼可以用于編碼10^6量級(jí)的aaRS突變體，在對(duì)篩選出的tRNA進(jìn)行測(cè)序后可以通過條形碼的序列來指認(rèn)有活性的aaRS上攜帶的突變。作者以N-Boc-賴氨酸和m-碘代苯丙氨酸為例進(jìn)行了篩選，他們?cè)趍aPylRS口袋內(nèi)的三個(gè)氨基酸位點(diǎn)(Leu125, Asn166, Val168)處引入了所有可能的20種氨基酸的密碼子庫，相當(dāng)于32768種不同的突變體。通過篩選在加入非天然氨基酸前后富集程度較高的突變體，作者發(fā)現(xiàn)N-Boc-賴氨酸的確富集在了WT蛋白上，這與WT蛋白本身能夠連接N-Boc-賴氨酸吻合。m-碘代苯丙氨酸對(duì)應(yīng)的突變體經(jīng)過驗(yàn)證的確能夠成功將其插入GFP，并在質(zhì)譜上得到了驗(yàn)證。最后作者還展示了START技術(shù)有可能實(shí)現(xiàn)對(duì)非α-氨基酸的篩選，包括α-羥基酸等。總之，這篇文章開發(fā)了一種無需在核糖體翻譯過程即可對(duì)aaRS突變體進(jìn)行篩選的策略，避免了核糖體對(duì)一些非天然氨基酸識(shí)別問題對(duì)篩選帶來的困難。原文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscentsci.3c01557文章引用：https://doi.org/10.1021/acscentsci.3c01557
