近日，南方科技大學(xué)王杰課題組在J. Am. Chem. Soc.雜志上發(fā)表了題為“Genetically Encoded Epoxide Warhead for Precise and Versatile Covalent Targeting of Proteins”的論文。
在這項(xiàng)工作中，作者開(kāi)發(fā)了全新的帶有環(huán)氧乙烷結(jié)構(gòu)的非天然氨基酸（EPOY），用于介導(dǎo)蛋白-蛋白互作界面間的化學(xué)交聯(lián)，實(shí)現(xiàn)了一個(gè)活性反應(yīng)基團(tuán)對(duì)多達(dá)10種天然氨基酸側(cè)鏈(H，M，C，K，D，E，Y，S，T，R)的廣譜鄰近交聯(lián)（圖1）。基于鄰近交聯(lián)的互作匹配（binding match）和化學(xué)匹配（reactivity match）的雙重選擇性，作者通過(guò)對(duì)KRAS蛋白的His-95殘基的共價(jià)靶向，在實(shí)現(xiàn)了對(duì)各種不同KRAS致癌突變體（G12-C/D/V/A/R/S, G13-C/D, Q61H）的廣譜性共價(jià)交聯(lián)的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)KRAS、NRAS和HRAS的選擇性共價(jià)靶向，為新一代pan-KRAS共價(jià)抑制劑（共價(jià)靶向His-95）的開(kāi)發(fā)提供有力的指引。圖1 EPOY非天然氨基酸及介導(dǎo)共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)示意圖近年來(lái)，共價(jià)藥物分子因其獨(dú)特的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效機(jī)制而被科學(xué)家們重視和關(guān)注。其中Bortezomib、ibrutinib、gefitinib等共價(jià)抑制劑相繼成功開(kāi)發(fā)讓共價(jià)藥物站在了新藥開(kāi)發(fā)的潮頭，KRAS-G12C的共價(jià)抑制劑Sotorasib的出現(xiàn)更是終結(jié)了KRAS這一重要靶點(diǎn)長(zhǎng)達(dá)30年不可成藥的歷史。共價(jià)靶向的策略可以顯著延長(zhǎng)藥物-靶標(biāo)有效作用時(shí)間，使半衰期較短的分子也可以通過(guò)共價(jià)靶向的方式與靶標(biāo)蛋白形成長(zhǎng)效作用。并且共價(jià)靶向的策略可以實(shí)現(xiàn)藥物分子在靶標(biāo)上的不可逆累積，實(shí)現(xiàn)較低親和力分子對(duì)高親和力分子的競(jìng)爭(zhēng)逆轉(zhuǎn)。受啟發(fā)于共價(jià)小分子抑制劑，共價(jià)蛋白藥物是近年來(lái)新興的蛋白藥物概念。尤其是對(duì)于小蛋白藥物而言，例如納米抗體、細(xì)胞因子等，通過(guò)共價(jià)的策略可以顯著延長(zhǎng)其與靶點(diǎn)蛋白的作用時(shí)長(zhǎng)，改善其藥代和藥效動(dòng)力學(xué)，提高成藥可能性。此外，由于共價(jià)蛋白藥物通過(guò)鄰近作用起效，所以必須同時(shí)進(jìn)行正確的藥物--靶標(biāo)“互作匹配”（binding match）以及“化學(xué)匹配”（reactivity match）才能與靶標(biāo)形成共價(jià)鍵，這種雙重匹配的機(jī)制進(jìn)一步提高了靶向藥物的特異性和目標(biāo)選擇性，大大降低脫靶風(fēng)險(xiǎn)。在過(guò)去的研究中，已經(jīng)有非天然氨基酸被開(kāi)發(fā)用于介導(dǎo)蛋白-蛋白互作界面的化學(xué)交聯(lián)。例如基于乙烯基磺酰胺基的VSF、pNCSF和基于丙烯酰胺官能團(tuán)的AcrK、AcrF，基于鹵素的BrC6K、FPheK，以及基于磺酰氟官能團(tuán)的非天然氨基酸FSY、FSK等。然而，大多數(shù)共價(jià)交聯(lián)基團(tuán)面臨交聯(lián)效率低以及穩(wěn)定性不足等問(wèn)題?；酋７Y(jié)構(gòu)在一定程度上解決了交聯(lián)效率和穩(wěn)定性的問(wèn)題，基于六價(jià)硫氟交換反應(yīng)的FSY非天然氨基酸因具備較好的生物正交性、穩(wěn)定性和較高的交聯(lián)效率，使得共價(jià)蛋白藥物得到了快速的發(fā)展，并在后續(xù)的研究中被廣泛用來(lái)開(kāi)發(fā)共價(jià)型的CAR-T，共價(jià)型的膜蛋白降解劑和共價(jià)型的細(xì)胞因子。但磺酰氟結(jié)構(gòu)所能共價(jià)靶向的天然氨基酸殘基種類有限，僅能共價(jià)靶向少數(shù)幾種氨基酸側(cè)鏈（H, K, Y）?？紤]到蛋白質(zhì)相互作用界面上的氨基酸種類繁多，其他具備親核性的氨基酸側(cè)鏈暫時(shí)未能實(shí)現(xiàn)共價(jià)靶向，這也在一定程度上限制了共價(jià)蛋白藥物的發(fā)展。因此，開(kāi)發(fā)可遺傳編碼、生物相容性好、鄰近交聯(lián)反應(yīng)范圍廣的共價(jià)反應(yīng)基團(tuán)，是發(fā)展共價(jià)蛋白藥物的關(guān)鍵。圖2 FDA批準(zhǔn)的帶有環(huán)氧乙烷結(jié)構(gòu)的藥物分子基于這一標(biāo)準(zhǔn)，作者把目光轉(zhuǎn)向了環(huán)氧乙烷結(jié)構(gòu)。環(huán)氧乙烷是一種相對(duì)穩(wěn)定和安全的官能團(tuán)，美國(guó)食品與藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)的幾種藥物的結(jié)構(gòu)中都含有環(huán)氧乙烷結(jié)構(gòu)，這證明了它在生理?xiàng)l件下的穩(wěn)定性和安全性（圖2）。此外，環(huán)氧乙烷還是一種高活性官能團(tuán)，具備與各類氨基酸側(cè)鏈的親核基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)的潛力；同時(shí)，環(huán)氧乙烷的化學(xué)反應(yīng)活性可通過(guò)三元環(huán)上的取代基進(jìn)行微調(diào)。因此，環(huán)氧乙烷結(jié)構(gòu)具備了活體穩(wěn)定性、廣譜反應(yīng)性和反應(yīng)性可調(diào)的特點(diǎn)，有望成為共價(jià)蛋白交聯(lián)的理想官能團(tuán)。
圖3 環(huán)氧乙烷非天然氨基酸的設(shè)計(jì)在此項(xiàng)研究工作中，作者設(shè)計(jì)并開(kāi)發(fā)了攜帶有環(huán)氧乙烷共價(jià)反應(yīng)基團(tuán)的非天然氨基酸EPOY。根據(jù)交聯(lián)臂長(zhǎng)以及環(huán)氧反應(yīng)活性的可調(diào)性，作者設(shè)計(jì)合成了三種EPOY（圖3）并通過(guò)定向進(jìn)化分別得到了可以識(shí)別三種EPOY氨基酸的氨酰tRNA合成酶（EPOY-RS），實(shí)現(xiàn)了對(duì)三種EPOY非天然氨基酸的遺傳編碼，可以將基于環(huán)氧乙烷的共價(jià)反應(yīng)基團(tuán)引入到目標(biāo)蛋白的特定位點(diǎn)。圖4 環(huán)氧乙烷酪氨酸（EPOY3）的鄰近化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)性研究隨后，作者在免疫檢查點(diǎn)PD-L1和納米抗體KN035中測(cè)試驗(yàn)證了EPOY介導(dǎo)蛋白-蛋白互作界面共價(jià)交聯(lián)的能力。作者將EPOY3定點(diǎn)插入納米抗體KN035的L108位，并將PD-L1的69位H突變?yōu)?種其它具有親核能力的氨基酸，同時(shí)構(gòu)建H69A作為負(fù)對(duì)照，作者發(fā)現(xiàn)環(huán)氧乙烷可以與全部10種氨基酸殘基發(fā)生共價(jià)交聯(lián)且不與H69A突變體發(fā)生反應(yīng)，這表明環(huán)氧乙烷可以精準(zhǔn)介導(dǎo)納米抗體KN035與PD-L1蛋白發(fā)生位點(diǎn)特異性的共價(jià)交聯(lián)。作為對(duì)照，F(xiàn)SY在相同的相互作用界面和位點(diǎn)，僅能交聯(lián)3種氨基酸側(cè)鏈。在隨后的研究中，作者基于可遺傳編碼的環(huán)氧乙烷酪氨酸（EPOY）設(shè)計(jì)了可以廣譜性共價(jià)靶向KRAS致癌突變的泛KRAS共價(jià)結(jié)合蛋白，同時(shí)利用環(huán)氧乙烷對(duì)氨基酸側(cè)鏈的化學(xué)選擇性，實(shí)現(xiàn)了對(duì)KRAS、NRAS和HRAS選擇性共價(jià)靶向。KRAS蛋白的突變是許多癌癥中的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素，針對(duì)KRAS的藥物開(kāi)發(fā)長(zhǎng)期以來(lái)一直面臨挑戰(zhàn)。KRAS-G12C突變體的共價(jià)抑制劑的成功，促進(jìn)了其他KRAS突變抑制劑的快速發(fā)展。在最近的研究中，針對(duì)KRAS的G12D、G12R、G12S等突變也實(shí)現(xiàn)了共價(jià)靶向。然而，KRAS的其他多種致癌突變，如G12V、G12A和G13D，目前還缺乏有效的共價(jià)靶向方法，同時(shí)，共價(jià)靶向KRAS-SWITCH Ⅱ附近的致癌突變，其所開(kāi)發(fā)的小分子抑制劑極易產(chǎn)生耐藥性，因此發(fā)展一種能同時(shí)抑制KRAS多種致癌突變的泛抑制策略顯得尤為重要（圖5）。作者認(rèn)為要實(shí)現(xiàn)這樣的目標(biāo)，需要靶向KRAS的特定表位。該表位的空間構(gòu)象應(yīng)當(dāng)保持恒定，不受KRAS致癌突變的影響，也即不同的KRAS突變體之間蛋白構(gòu)象重疊的較好的區(qū)域，這樣的表位才具備泛KRAS靶向的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。而這又帶來(lái)另一個(gè)問(wèn)題，KRAS的同源蛋白HRAS/NRAS與KRAS在序列和結(jié)構(gòu)上高度類似，KRAS的構(gòu)象不受致癌突變影響區(qū)域，恰好也是K/N/H-RAS構(gòu)象高度重疊的區(qū)域。如果靶向此區(qū)域（表位），在抑制KRAS的同時(shí)，也會(huì)抑制NRAS和HRAS的功能，這將帶來(lái)嚴(yán)重的副作用。因而，如何實(shí)現(xiàn)對(duì)不同KRAS突變體廣譜靶向的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)對(duì)KRAS和HRAS/NRAS的精確區(qū)分是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)（圖5）。圖5 pan-KRAS共價(jià)靶向的機(jī)遇與挑戰(zhàn)作者對(duì)9種KRAS不同突變體的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)KRAS-H95所在的第三螺旋（86-110）結(jié)構(gòu)的構(gòu)象在不同的突變體結(jié)構(gòu)相對(duì)保持恒定，是理想的pan-KRAS靶向的結(jié)構(gòu)區(qū)域，為開(kāi)發(fā)泛KRAS結(jié)合劑提供了可能。同時(shí)，通過(guò)對(duì)KRAS、HRAS、NRAS進(jìn)行序列比對(duì)，作者發(fā)現(xiàn)在第三螺旋的95位和107位，KRAS擁有區(qū)別于HRAS、NRAS的氨基酸側(cè)鏈（圖5）。對(duì)于95位，KRAS上是組氨酸（H），NRAS上的是亮氨酸（L），HRAS上的是谷氨酰胺（Q），NRAS和HRAS上95號(hào)位的兩種殘基均不具備反應(yīng)性，靶向H95殘基可以實(shí)現(xiàn)K/N/H-RAS之間的選擇性。類似地，對(duì)于107位，KRAS、NRAS和HRAS上的分別是谷氨酸（E）、天冬氨酸（D）和天冬氨酸（D）。盡管它們的側(cè)鏈都含有相同的反應(yīng)基團(tuán)（羧基），但天冬氨酸的側(cè)鏈比谷氨酸短一個(gè)碳原子，由于空間位阻和距離的原因，同樣有可能產(chǎn)生K/N/H-RAS之間的選擇性（圖5）。圖6 共價(jià)靶向H95實(shí)現(xiàn)對(duì)KRAS、HRAS/NRAS選擇性基于上述分析設(shè)計(jì)，作者選擇了可以靶向KRAS這一區(qū)域的結(jié)合蛋白DARPin-K13。DARPin是一類特殊的支架蛋白，通過(guò)改變結(jié)合界面的氨基酸和定向進(jìn)化，DARPin可以與不同的目標(biāo)蛋白結(jié)合，而DARPin-K13是通過(guò)噬菌體展示技術(shù)篩選到的KRAS結(jié)合蛋白。作者圍繞KRAS-H95和E107作為共價(jià)靶向目標(biāo)，通過(guò)遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)將環(huán)氧乙烷結(jié)構(gòu)引入DARPin-K13和KRAS蛋白的互作界面，并對(duì)EPOY3的插入位點(diǎn)進(jìn)行了系統(tǒng)性的篩選。作者發(fā)現(xiàn)將環(huán)氧乙烷引入DARPin-K13的W35位可以共價(jià)交聯(lián)KRAS-H95，將環(huán)氧乙烷引入DARPin-K13的K133位可以共價(jià)交聯(lián)KRAS-E107。作者測(cè)試了在W35位點(diǎn)引入EPOY3后，DARPin-K13對(duì)于KRAS和HRAS與NRAS之間的選擇性。作者分別利用表達(dá)有KRAS、HRAS和NRAS的細(xì)胞裂解液與DARPin-K13進(jìn)行孵育，結(jié)果顯示DARPin-K13僅交聯(lián)KRAS，而HRAS和NRAS不會(huì)與DARPin發(fā)生交聯(lián)，這表明共價(jià)靶向KRAS-H95和E107均可以實(shí)現(xiàn)對(duì)KRAS與HRAS/NRAS的選擇性（圖6）。隨后作者測(cè)試了腫瘤中突變頻率最高的KRAS前10種突變體，將過(guò)表達(dá)有不同突變體的細(xì)胞裂解液與DARPin-K13-W35-EPOY3孵育，結(jié)果表明DARPin-K13-W35-EPOY3可以與其中9種發(fā)生共價(jià)反應(yīng)（圖7），突變率覆蓋度高達(dá)85%以上，證明了共價(jià)靶向H95可以實(shí)現(xiàn)對(duì)KRAS致癌突變體的廣譜靶向。總之，在本文中，作者通過(guò)開(kāi)發(fā)一種全新的環(huán)氧乙烷結(jié)構(gòu)的非天然氨基酸，在蛋白互作界面實(shí)現(xiàn)對(duì)多種天然氨基酸側(cè)鏈的廣譜鄰近交聯(lián)。通過(guò)共價(jià)靶向KRAS的H95位，作者成功發(fā)展了一種KRAS蛋白的選擇性泛抑制策略，不僅可以實(shí)現(xiàn)對(duì)各種不同KRAS致癌突變體的廣譜性共價(jià)靶向，還可以在K/N/H-RAS之間產(chǎn)生很好的選擇性，為新一代KRAS共價(jià)抑制劑的開(kāi)發(fā)提供有力的參考。本文的通訊作者為南方科技大學(xué)化學(xué)系王杰副教授。南方科技大學(xué)化學(xué)系2023級(jí)博士張金鵬、2022級(jí)博士生王霞和研究助理黃清俊為本文的共同第一作者，2021級(jí)碩士生葉錦松亦為本研究做出了貢獻(xiàn)。該工作得到了國(guó)家自然科學(xué)基金委、科技部國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、北京分子科學(xué)國(guó)家研究中心、深圳市科創(chuàng)委、深圳市醫(yī)學(xué)科院等項(xiàng)目的支持。原文鏈接：
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.4c03974
