推薦一篇發(fā)表在NCB上的文章，題目為“Antibody–peptide conjugates deliver covalent inhibitors blocking oncogenic cathepsins”，通訊作者是來自瑞士洛桑聯(lián)邦理工學(xué)院的兩位科學(xué)家Bruno E. Correia?和Elisa Oricchio，前者的研究方向?yàn)榈鞍踪|(zhì)工程，后者為致癌基因組的研究和功能分析。
半胱氨酸組織蛋白酶（cysteine cathepsins）是一個(gè)蛋白酶家族，是治療癌癥等疾病的靶點(diǎn)。然而，還沒有任何以該蛋白為靶點(diǎn)的藥物被批準(zhǔn)用于臨床，因?yàn)樗鼈兊南到y(tǒng)性抑制會(huì)引起嚴(yán)重的副作用。因此，作者通過將非天然肽抑制劑（non-natural peptide inhibitors, NNPIs）偶聯(lián)到抗體上，開發(fā)了一個(gè)基于模塊化抗體的靶向藥物遞送平臺(tái)。NNPIs被活性彈頭功能化以實(shí)現(xiàn)共價(jià)抑制，通過深度飽和誘變優(yōu)化后與抗體偶聯(lián)以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞類型特異性的藥物遞送。
作者首先以從cathepsin S（CTSS）的底物CD74序列中提取的八聚肽LRMKLPKP為模板，在N端添加賴氨酸以備將來的功能化，并在C端用天冬氨酸取代脯氨酸，因?yàn)樗黾恿穗呐cCTSS結(jié)合的能力。作者在四個(gè)不同的位置引入Michael受體，嘗試設(shè)計(jì)共價(jià)抑制劑，其中NNPI-1和NNPI-2的Michael受體在肽鏈的側(cè)鏈，NNPI-3的受體作為骨架取代了原本的亮氨酸，NNPI-4的受體則在截短肽的N端。作者通過使用熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）試驗(yàn)，測(cè)試了這些 NNPIs抑制CTSS的能力，并發(fā)現(xiàn)只有NNPI-3 降低了蛋白酶活性，盡管效率較低，NNPI-3也可以抑制CTSB和CTSK，但對(duì)H、Z和L沒有可測(cè)量的活性。因此。作者構(gòu)建了一個(gè)含有126個(gè)NNPIs的文庫(kù)，通過單位點(diǎn)飽和突變優(yōu)化NNPI的抑制效果和特異性。然后根據(jù)單位點(diǎn)突變的結(jié)果測(cè)試雙突變對(duì)酶活抑制效率的影響，并最終確定NNPI-C10是最有效的CTSS抑制劑（部分抑制CTSB），NNPI-D5是CTSB的高特異性抑制劑。作者還發(fā)現(xiàn)NNPI-E15是一種很有前景的CTSK抑制劑，因此作者用NNPI-E15作為第二個(gè)NNPI庫(kù)的起點(diǎn)，并確定NNPI-F17是最佳的CTSK抑制劑，NNPI-G14是最佳的CTSKL抑制劑。
為了證明NNPI-C10和CTSS的共價(jià)結(jié)合，作者將熒光化的NNPI-C10和CTSS蛋白孵育后進(jìn)行凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)預(yù)期蛋白分子量處成功出現(xiàn)熒光條帶，并可以被預(yù)孵育CTSS的小分子抑制劑E64競(jìng)爭(zhēng)。而先孵育NNPI-C10，在再孵育E64則不能使熒光條帶消失，證明NNPI-C10的抑制是不可逆的共價(jià)結(jié)合。此外，作者用單鍵取代Michael受體中的雙鍵，發(fā)現(xiàn)這種改變消除了其共價(jià)阻斷CTSS活性的能力。作者還在變性條件下使用完整質(zhì)譜分析進(jìn)一步證實(shí)了CTSS和NNPI之間形成了共價(jià)鍵。最后，作者通過獲得了CTSS蛋白和NNPI-C10的結(jié)晶，證明了NNPI-C10在催化口袋中的結(jié)合正如期望的那樣，Michael受體與催化中心的C139形成共價(jià)鍵。
最后，作者利用馬來酰亞胺化學(xué)，設(shè)計(jì)了一系列設(shè)計(jì)了抗體-肽抑制劑偶聯(lián)物（antibody-peptide inhibitor conjugates, APIC）將NNPI-C10與anti-CD22或anti-CD79抗體結(jié)合靶向B細(xì)胞淋巴瘤，NNPI-D5與anti-HER2抗體偶聯(lián)，靶向乳腺癌細(xì)胞，阻斷實(shí)體腫瘤中CTSB的活性，而NNPI-F17和NNPI-G14與anti-SIGLEC-15抗體偶聯(lián)，靶向破骨細(xì)胞或癌癥細(xì)胞，分別抑制CTSK和CTSL。通過質(zhì)譜和western blot證明了CTSS-APIC復(fù)合物在體外的形成，說明NNPI不需要從抗體中釋放來結(jié)合CTSS。作者還通過設(shè)計(jì)熒光探針證明APIC可以和靶向細(xì)胞表面的受體結(jié)合，然后被細(xì)胞內(nèi)吞，并在溶酶體中降解并抑制組織蛋白酶的活性。在活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，APIC可以導(dǎo)致組織蛋白酶底物，伴侶蛋白CD74的積累。在小鼠CD8+ T細(xì)胞和淋巴瘤細(xì)胞的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，CTSS活性的喪失和CD74的積累將導(dǎo)致抗原呈遞的改變，從而允許CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞識(shí)別腫瘤細(xì)胞并激活抗腫瘤反應(yīng)。并發(fā)現(xiàn)APIC可以阻礙乳腺癌細(xì)胞的遷移。在使用人類癌細(xì)胞的臨床前小鼠腫瘤模型中，作者可以特異性地將APICs傳遞到腫瘤并抑制靶標(biāo)活性，并使CD8+ T細(xì)胞增加。
總之，作者利用基于抗體的平臺(tái)，通過特異性抗體-NNPI的組合靶向不同的組織蛋白酶，可以在不同的腫瘤類型中引發(fā)治療性抗腫瘤反應(yīng)。原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41589-024-01627-z文章引用：https://doi.org/10.1038/s41589-024-01627-z
