分享一篇發(fā)表在Cell Chem. Biol.上的文章，題目為Specificity profiling of deubiquitylases against endogenously generated ubiquitin-protein conjugates。本文通訊作者為哈佛醫(yī)學(xué)院的Randall W. King教授。King課題組致力于揭示泛素-蛋白酶體系統(tǒng)在細(xì)胞分裂過(guò)程中的作用。
去泛素化酶（DUBs）能清除蛋白質(zhì)的泛素化修飾，從而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性或活性。人類基因組中編碼的DUBs約有100種，根據(jù)其作用機(jī)制分為兩大類：一大類是半胱氨酸蛋白酶，一小類是鋅依賴金屬蛋白酶。半胱氨酸蛋白酶DUB又進(jìn)一步細(xì)分為幾個(gè)家族，包括 UCH、USP、OTU、MINDY、MJD和ZUFSP。USP家族是最大的家族，包含56個(gè)DUBs。目前，研究人員對(duì)DUB-底物的特異性了解很有限，因?yàn)槿狈︶槍?duì)生理底物比較不同DUBs的研究方法。在此前工作中，King課題組發(fā)展了乙烯基砜修飾的泛素（UbVS），進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了半胱氨酸蛋白酶DUBs的廣譜性抑制。在本文中，研究人員使用內(nèi)源的泛素組作為底物，系統(tǒng)研究了30個(gè)DUBs的底物選擇性。
首先，作者將爪蟾卵提取物與UbVS共孵育，以抑制內(nèi)源的DUBs。隨后，將單個(gè)重組人DUB（800 nM）與 HA修飾泛素一起加入并孵育。HA-泛素-蛋白偶聯(lián)物經(jīng)免疫純化，并通過(guò)基于TMT的定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法進(jìn)行表征。上述流程能夠穩(wěn)定鑒定到968個(gè)泛素化修飾蛋白，其中374個(gè)蛋白是所測(cè)試DUBs的潛在底物。作者發(fā)現(xiàn)了五種高影響DUBs（USP7、USP9X、USP36、USP15和USP24），每種DUBs都能減少10%以上分離蛋白的泛素化。對(duì)泛素組中蛋白功能進(jìn)行聚類，結(jié)果表明中心體蛋白和異質(zhì)性核蛋白（HNRNPs）對(duì)DUBs高度敏感；而代謝酶、蛋白酶/肽酶、tRNA 合成酶和UB/UBL E1酶對(duì)DUB幾乎完全不敏感。
在374個(gè)潛在底物中，124個(gè)（33%）僅被單一DUB切割，而93個(gè)底物能夠被超過(guò)5個(gè)DUBs切割，表現(xiàn)出差異的底物特異性。高影響DUB的候選底物顯示出大量重疊，并且富含無(wú)序區(qū)域，這表明這一特征可能會(huì)促進(jìn)底物識(shí)別。其他DUBs顯示出較低的影響和非重疊特異性，它們以不同的非無(wú)序蛋白為靶標(biāo)，包括核糖體或蛋白酶體等復(fù)合物。
