分享一篇發(fā)表在JACS上的文章,題目為“A Lung-Expressing mRNA Delivery Platform with Tunable Activity in Hypoxic Environments”。mRNA傳遞平臺(tái)通常在靜脈注射后促進(jìn)肝臟中的蛋白質(zhì)表達(dá)，并已優(yōu)化用于正常氧合細(xì)胞。許多疾病的特征是缺氧，可使mRNA治療的療效降低80%以上。在這里，作者報(bào)道了一個(gè)用于mRNA遞送的可調(diào)節(jié)肺表達(dá)納米顆粒平臺(tái)(TULEP)，在缺氧環(huán)境下能有最佳表達(dá)。簡(jiǎn)而言之，作者的研究從一種新型氨基丙烯酸酯聚合物的合成和表征開始，這種聚合物可以有效地與mRNA有效載荷絡(luò)合成TULEPs。作者研究了利用TULEP傳遞mRNA的功效和機(jī)制。然后，作者評(píng)估了缺氧條件下的TULEP，并通過(guò)使用ATP調(diào)節(jié)來(lái)解決缺氧相關(guān)的功效缺陷。最后，作者分析了TULEP平臺(tái)在小鼠體內(nèi)的mRNA表達(dá)、生物分布和耐受性。
為了開發(fā)一種肺表達(dá)和缺氧可調(diào)的mRNA PNP，作者首先設(shè)計(jì)并合成了一種新型的氨基丙烯酸酯(AA)聚合物，通過(guò)在溫和的反應(yīng)條件下將低分子量支化聚乙烯亞胺(PEI)與6-碳炔酸鹽尾部反應(yīng)。這種新型聚合物結(jié)合了幾種可能有利于mRNA遞送的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)特性，(1)高胺密度促進(jìn)與mRNA的有效絡(luò)合，(2)酯鍵促進(jìn)耐受性，(3)疏水尾巴促進(jìn)自組裝，(4)基于聚乙烯亞胺(PEI)的化學(xué)促進(jìn)遞送到肺部，(5)可調(diào)節(jié)性，使其活性可以在常氧和缺氧條件下進(jìn)行優(yōu)化。接下來(lái)，作者研究了新型AA聚合物將mRNA有效載荷復(fù)合到TULEP中的能力。作者首先通過(guò)AA聚合物和編碼螢火蟲熒光素酶（FLuc）報(bào)告基因的mRNA混合來(lái)制備TULEP;然而，該制劑在PBS中缺乏穩(wěn)定性，因此被認(rèn)為不適合長(zhǎng)期使用。為了解決這個(gè)問(wèn)題，作者假設(shè)在配方中添加PEG衍生物可以提供更好的穩(wěn)定性，同時(shí)還可對(duì) TULEP 的特性進(jìn)行調(diào)節(jié)，這可能對(duì)mRNA遞送很重要，包括其大小、電荷和封裝效率。為此，作者制定并表征了一系列具有不同PEG摩爾比、頂部基團(tuán)、PEG分子量和N/P比的TULEPs。還進(jìn)行了透射電子顯微鏡以評(píng)估TULEP的表征。在對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行集體分析時(shí)，出現(xiàn)了幾個(gè)趨勢(shì)。首先，增加PEG的摩爾比或PEG尾部的長(zhǎng)度導(dǎo)致PNP大小的普遍減小，而頂部基團(tuán)對(duì)大小的影響最小。其次，在PEG摩爾比、頂部基團(tuán)和分子量的變化對(duì)電荷的影響不大。第三，所有研究制劑的mRNA封裝率均大于80%。第四，用PNP制劑處理的A549細(xì)胞的FLuc表達(dá)水平和活力受PEG 摩爾比、頂部基團(tuán)和分子量的影響?；谶@些結(jié)果，作者選擇使用0.25 mol%的PEG百分比、C14 PEG頂部基團(tuán)和PEG分子量1K、2K、3K和5K進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，因?yàn)檫@些設(shè)計(jì)表征在各自的參數(shù)研究中產(chǎn)生了最高的mRNA表達(dá)水平（如圖1）。
圖1 基于這些功效結(jié)果，作者隨后研究TULEP在體外遞送mRNA的機(jī)制。包裹在納米顆粒中的mRNA要在處理過(guò)的細(xì)胞中表達(dá)，納米顆?？梢越?jīng)歷幾個(gè)步驟，包括細(xì)胞結(jié)合（納米顆粒與細(xì)胞膜相互作用）、內(nèi)吞作用（納米顆粒通過(guò)各種途徑被吸收到細(xì)胞中）和內(nèi)體逃逸（納米顆粒從內(nèi)體/溶酶體釋放到細(xì)胞質(zhì)中）。因此，作者通過(guò)對(duì)TULEP進(jìn)行細(xì)胞關(guān)聯(lián)實(shí)驗(yàn)開始了作者的機(jī)理研究。簡(jiǎn)而言之，這些研究是通過(guò)用具有可變PEG分子量的熒光標(biāo)記（Cy5 FLuc mRNA）TULEP配方處理A549細(xì)胞來(lái)進(jìn)行的。然后，在2小時(shí)和24小時(shí)對(duì)每個(gè)TULEP配方的Cy5陽(yáng)性A549細(xì)胞的百分比進(jìn)行定量，作為基準(zhǔn)對(duì)照，還對(duì)用Cy5 FLuc mRNA封裝的 Moderna LNP 配方處理的A549細(xì)胞進(jìn)行了相同的實(shí)驗(yàn)。在共同分析這些結(jié)果時(shí)，觀察到每種TULEP配方與A549細(xì)胞的細(xì)胞關(guān)聯(lián)性都高于Moderna LNP 配方基準(zhǔn)。 然后進(jìn)行內(nèi)吞途徑機(jī)制研究，是通過(guò)用具有可變PEG分子量的熒光標(biāo)記（Cy5 FLuc mRNA）TULEP配方處理A549細(xì)胞（其內(nèi)吞途徑被分子抑制劑抑制）進(jìn)行的。然后確定每種配方的有效抑制率（即抑制與非抑制Cy5+ A549細(xì)胞的比率），作為基準(zhǔn)對(duì)照，還使用Cy5 FLuc mRNA封裝的 Moderna LNP 配方進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)。在分析這些數(shù)據(jù)時(shí)，觀察到用 TULEP處理的Cy5+ A549細(xì)胞的百分比僅受細(xì)胞松弛素D的影響，而用 Moderna LNP處理的Cy5+ A549細(xì)胞的百分比受所研究的4種抑制劑的影響。這些結(jié)果表明，A549細(xì)胞可能利用內(nèi)吞作用作為TULEP的一種特定途徑。在此基礎(chǔ)上，作者下一步試圖利用定性和定量方法研究A549細(xì)胞中TULEPs的內(nèi)體逃逸特性。作為基準(zhǔn)對(duì)照，同樣的共聚焦成像實(shí)驗(yàn)也用Cy5 FLuc mRNA包封的Moderna LNP制劑處理A549細(xì)胞。對(duì)這些數(shù)據(jù)的分析揭示了兩個(gè)關(guān)鍵觀察結(jié)果:首先，PEG分子量影響TULEPs處理的A549細(xì)胞的PCC值;其次，含有C14 PEG 1K和2K的TULEP配方的PCC值低于Moderna LNPs。綜上所述，這些結(jié)果表明，相對(duì)于Moderna LNP制劑，選擇的TULEP制劑在A549細(xì)胞中表現(xiàn)出更好的內(nèi)體逃逸特性（如圖2）。 圖2
作者試圖更好地了解V-ATP酶(一種質(zhì)子泵，可以促進(jìn)質(zhì)子流入內(nèi)體/溶酶體并影響質(zhì)子海綿效應(yīng))的抑制如何影響TULEPs的內(nèi)體逃逸。為了評(píng)估這一點(diǎn)，作者試圖利用流式細(xì)胞術(shù)來(lái)評(píng)估表達(dá)傳遞mRNA的處理細(xì)胞百分比的減少。為此，作者選擇在本實(shí)驗(yàn)中傳遞Cy5標(biāo)記的編碼增強(qiáng)綠色熒光蛋白(EGFP)的mRNA(考慮到EGFP可以使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè))。作者用可變PEG分子量的熒光標(biāo)記(Cy5 EGFP mRNA)包封TULEPs處理A549細(xì)胞(其V-ATPase活性被巴菲霉素A1抑制)。然后，作者量化EGFP+ A549細(xì)胞減少的百分比，作為內(nèi)體逃逸減少的測(cè)量，導(dǎo)致EGFP mRNA翻譯減少(如圖3)。作為對(duì)照和基準(zhǔn)，在使用Cy5 EGFP mRNA包封的Moderna LNP制劑處理的A549細(xì)胞中，也量化了這一百分比的降低。在此基礎(chǔ)上，作者還試圖了解同時(shí)抑制V-ATPase和特定細(xì)胞攝取途徑如何影響TULEPs的活性。為此，作者同時(shí)用巴菲霉素A1和一種抑制劑(filipin)處理A549細(xì)胞，以抑制小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用;Pitstop 2 -抑制網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用;EIPA -抑制巨紅細(xì)胞增多癥;或細(xì)胞松弛素D -抑制吞噬作用)。然后用可變PEG分子量的熒光標(biāo)記(Cy5 EGFP mRNA)封裝的TULEPs處理這些被抑制的細(xì)胞群，并量化每組EGFP+細(xì)胞的減少百分比，以及類似的Cy5 EGFP mRNA封裝的Moderna LNP基準(zhǔn)對(duì)照。在對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行集體分析時(shí)，觀察到兩個(gè)關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)。首先，巴菲霉素A1的抑制作用普遍降低了EGFP+ A549細(xì)胞中TULEPs的百分比，這表明V-ATPase活性可能在A549細(xì)胞中TULEPs的活性中起作用。值得注意的是，在使用Moderna LNP基準(zhǔn)對(duì)照處理的細(xì)胞中，這種減少明顯更高，這突出表明TULEPs和Moderna mRNA LNPs可能利用不同的內(nèi)體逃逸機(jī)制途徑。其次，與PEG分子量無(wú)關(guān)，TULEP的活性受到細(xì)胞松弛素D和巴霉素A1抑制的影響最大，這表明吞噬途徑和V-ATPase活性可能對(duì)作者的TULEP平臺(tái)的機(jī)制活性都很重要。為了進(jìn)一步證實(shí)這些發(fā)現(xiàn)，作者還試圖研究一種無(wú)標(biāo)記方法（即TULEP制劑中不存在熒光團(tuán)的方法）。簡(jiǎn)而言之，在用具有可變PEG分子量的 FLuc mRNA TULEP或 FLuc mRNA封裝的Moderna LNP基準(zhǔn)對(duì)照處理后，使用共聚焦顯微鏡對(duì)浸漬鈣黃綠素（一種膜不可滲透的綠色染料，仍被捕獲在完整的內(nèi)體內(nèi)體內(nèi)，但如果內(nèi)/溶酶體破裂，則分布在整個(gè)細(xì)胞中）浸漬的A549細(xì)胞。同樣的成像方法也對(duì)單獨(dú)用巴弗洛霉素A1抑制的鈣黃綠素浸漬的A549細(xì)胞或用巴弗洛霉素A1 和細(xì)胞松弛素D抑制，這些細(xì)胞也用TULEPs處理。對(duì)這些圖像的集體分析表明，鈣黃綠素在非抑制的A549細(xì)胞中在整個(gè)細(xì)胞中的擴(kuò)散最大，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了吞噬途徑和V-ATP酶活性對(duì)TULEP活性的可能重要性。
圖3
本文作者：FSY 責(zé)任編輯：TZM DOI: 10.1021/jacs.4c04565 原文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/jacs.4c04565
