分享一篇發(fā)表在Sensors and Actuators B: Chemical上的文章，題目是“NADH- induced “kick-on” fluorescent probe validates crosstalk with redox regulator GSH”，文章的通訊作者為JIS Institute of Advanced Studies and Rsearch的Sankarprasad Bhuniya副教授。
氧化還原偶對1,4-二氫煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH/NAD+)是真核細胞中普遍存在的電子轉運體。NADH作為中心代謝過程的輔酶，通過三羧酸循環(huán)(TCA)、糖酵解和戊糖磷酸途徑將碳源轉化為各種分子前體。代謝通量嚴格控制NADH/NAD+的比例，以完成各種代謝和分解過程，將不同的大分子轉化為能量。然而，NADH水平的升高會擾亂多種代謝過程，從而可能引發(fā)ROS的形成、DNA損傷和癌癥轉移此外，高糖酵解通量提高了NADH水平，維持了癌細胞增殖過程中對能量的高需求。因此，通過開發(fā)合適的激動劑或拮抗劑，操縱NADH水平可以成為停止各種代謝紊亂和癌癥生長的獨特解決方案。為此，需要一種有效的工具來評估單個細胞中NADH的表達，而不損害任何健康細胞；這將是化學選擇性的，能夠提供準確的信息，而不會受到活細胞中其他反應性時間物質的干擾。有幾種方法，如電化學，酶測定等，用于跟蹤活細胞中的NADH。除此之外，高靈敏度的熒光吸引策略材料，如小分子熒光探針、基因編碼蛋白和納米顆粒已被用于跟蹤活細胞中的NADH。最近，基于“推池”機制的幾種熒光探針被用于跟蹤活細胞中的NADH。一項新的研究表明，氧化還原偶、GSH/GSSG和NAD+/NADH的失衡改變了氧化還原穩(wěn)態(tài)，加速了生理性ROS的形成；這會引起各種生理障礙，如中風、血脂異常、糖尿病、高血壓等。因此，我們有興趣研究氧化還原對、NAD+/NADH和GSH/GSSG之間是否存在注釋效應；這可能為開發(fā)針對ROS誘導的致病性疾病的合適拮抗劑打開了新的窗口。因此，需要一種新的熒光探針，它可以合成簡單，并且可以在活細胞中快速精確檢測NADH。本文主要討論探針PNADH的合成路線、在NADH存在下其紫外可見光譜和熒光光譜的變化、熒光成像對活細胞中NADH的跟蹤以及與氧化還原調節(jié)劑GSH的串擾。為了證實我們的觀點，我們合成了一種新的開啟探針PNADH(方案1)來驗證活細胞中NADH的表達水平。
方案1. 熒光探針PNADH的合成及其在NADH存在下的分解。
在該策略中，NADH還原了PNADH中喹啉C4上的芳π鍵，促進了不穩(wěn)定碳酸鹽鍵的自燒裂解，釋放熒光團(FL)(方案1)。首先，我們評估了用不同濃度的NADH (0 ~ 400 μM)滴定探針PNADH檢測NADH的效價。探針PNADH在以552 nm為中心的熒光強度隨NADH的劑量線性增加，且呈良好的線性關系，系數(R)為0.987(圖1a)。此外，在時間依賴性熒光研究中(圖1b)；我們注意到~ 40分鐘后在400 μM NADH存在下，PNADH完全轉化為FL。NADH催化PNADH生成FL的時間依賴性也與時間保持良好的線性關系(R = 0.997)。由回歸方程得到的NADH計算值表明，探針PNADH可以檢測到最小1.25 μM的NADH。
圖1. a) pH 7.4時，PBS緩沖液(0.5% DMSO)中，用NADH (0 ~ 400 μM)滴定PNADH (5 μM)的發(fā)射光譜。b) PBS緩沖液(pH = 7.4)不同時間尺度(0 ~ 60 min)下PNADH (5 μM)與NADH 400 μM的熒光強度變化。
此外，我們使用Michaelis-menten和LineweaverBurk方程，通過確定動力學參數，如Michaelis常數(KM)、催化效率常數(kcat/KM)和周轉數(kcat)，估計了PNADH和NADH之間的催化反應效率。KM、kcat和kcat/KM的取值分別為37.72 μM、0.31 s?1和8.218 × 103 M?1 s?1(圖2)。較高的kcat/KM值表明PNADH是檢測NADH的良好候選。
圖2. a)不同PNADH濃度(0 ~ 20 μM)下100 μM NADH在552nm處隨時間變化的發(fā)射強度增量。b) Michaelis-Menten陰謀。c) NADH對PNADH還原的Lineweaver - Burke圖。d)在PBS緩沖溶液(0.5% DMSO)中，pH為7.4,100 μM的NADH在37°C下孵育60 min后，熒光強度與不同濃度的PNADH (0-20 μM)的關系。
為了驗證探針PNADH在活細胞中跟蹤NADH表達的能力，我們在時間依賴性研究中(圖3)，觀察到PNADH能夠在15分鐘內提供HeLa、MDA-MB 231和WI-38細胞的綠色通道圖像。之前Tang等人報道探針僅在10分鐘內提供圖像。這一發(fā)現表明該探針具有高度的細胞膜滲透性，并且對NADH具有反應性，可以避免活細胞中其他類似反應物質的干擾。此外，在劑量依賴性研究中，我們觀察到細胞標記程度隨著PNADH劑量(0-20 μM)的增加而增加(圖4)；這顯然是因為PNADH與細胞NADH之間的反應程度更大。
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