分享一篇近期發(fā)表在Anal. Chem.上的文章，題目是“Novel Near-Infrared Fluorescent Probe for Hepatocyte Growth Factor in Vivo Imaging in Surgical Navigation of Colorectal Cancer”。文章的通訊作者是江西中醫(yī)藥大學的潘華萍教授。
本文報導了一種針對肝細胞生長因子(HGF)的新型近紅外熒光探針V-1-GGGK-MPA，該探針在結直腸癌(CRC)的手術導航中展現出活體成像的潛力。盡管近年來結直腸癌治療有所進展，但復發(fā)率和肝臟轉移仍是導致預后不良的主要原因。研究團隊開發(fā)的V-1-GGGK-MPA探針，利用近紅外熒光染料標記，能夠特異性結合CRC中過表達的HGF，為實時腫瘤切除手術提供熒光引導。實驗顯示，V-1-GGGK肽段對HGF陽性的體外腫瘤細胞和體內腫瘤具有高特異性和選擇性。在多種皮下CRC模型中，注射后12小時，探針在腫瘤中的積累顯著，背景吸收低，腫瘤與結直腸的信噪比(SNR)值大于6。在SW480和HT29原位及肝臟轉移模型中，探針的攝取量經量化分析確認，腫瘤與結直腸和肝臟的SNR值分別為5.6±0.4、4.6±0.5和2.1±0.3、2.0±0.5，實現了腫瘤的精確成像，有助于手術導航。采用蛋白質印跡法評估 CRC SW480、HT29 和 HCT116 腫瘤組織以及三陰性乳腺癌（TNBC） MDA-MB-231 腫瘤組織中的 HGF 和 c-Met 表達水平。結果表明，HGF和c-Met在SW480、HT29和HCT116腫瘤組織中的表達相當，顯著高于MDA-MB-231腫瘤組織（圖1a），提示HGF和c-Met的表達呈正相關。此外，Western blot分析的結果表明，norleual及其類似肽V-1-GGGK通過抑制c-Met磷酸化有效地抑制了HGF誘導的c-Met激活（圖1b）。為了進一步研究V-1-GGGK-MPA的結合特性對SW480、HT29、HCT116 CRC和MDA-MB-231細胞進行了流式細胞術。在5μM濃度下，V-1-GGGK-MPA在SW480、HT29和HCT116細胞中表現出相當的結合，這明顯強于在MDA-MB-231細胞中觀察到的結合（圖1c-e）。這表明與 MDA-MB-231 細胞相比，HGF 在 SW480、HT29 和 HCT116 細胞中過表達，與蛋白質印跡結果一致。在10μM濃度下，V-1-GGGK-MPA與SW480細胞的結合似乎比HT29和HCT116細胞強得多（圖1c-e），表明SW480細胞中V-1-GGGK-MPA相關蛋白的水平更高。飽和度分析進一步提供了～3.6±0.28μM（SW480），～3.75±0.12μM（HT29）和～3.77±0.02μM（HCT116）的結合親和力值（圖1f）。
圖 1.HGF和c-Met表達，c-Met抑制和V-1-GGGK-MPA的結合特異性。（a） SW480、HT29、HCT116 和 MDA-MB-231 腫瘤組織中 HGF 和 c-Met 蛋白的表達水平 （n= 3）。（b） SW480 細胞 （n = 3） 中 HGF、V-1-GGGK 和 norleual 處理后的 c-Met 磷酸化水平。+ 表示管理，– 表示非管理。（c-e）SW480、HT29 和 HCT116 CRC 細胞中 V-1-GGGK-MPA 的結合分析 （n = 3）。在封閉實驗中加入V-1-GGGK-MPA之前，將20倍未標記的V-1-GGGK預孵育30分鐘（n = 3）。V-1-GGGK-NC-MPA作為具有擾亂序列的陰性對照 （NC） 組。（f） SW480、HT29 和 HCT116腫瘤細胞中 V-1-GGGK-MPA 的飽和度測定。
采用共聚焦激光顯微鏡監(jiān)測和可視化 HGF 陽性 SW480、HT29 和 HCT116 細胞中 V-1-GGGK-FITC隨時間的分布。在與V-1-GGGK-FITC孵育10分鐘內，HT29細胞的細胞膜中出現明顯的環(huán)狀熒光信號（圖2Ia），表明V-1-GGGK-FITC具有快速結合能力。30 和 60 分鐘后，觀察到增強的熒光信號和表現出局部或彌漫性細胞質熒光的細胞的存在（圖 2Ib），表明 HT29 細胞內化 V-1-GGGK-FITC，這是積累 V-1-GGGK-FITC 信號的關鍵方面。V-1-GGGK-FITC的綠色信號與質膜染料DID的紅色信號共定位（圖2Ib-e），證實了V-1-GGGK-FITC的膜定位，共定位系數為0.92。在存在未標記的 V-1-GGGK 作為特異性競爭物的情況下，V-1-GGGK-FITC 的綠色熒光幾乎完全消失（圖 2Ig），證實了 V-1-GGGK-FITC 的特異性結合。同樣，在V-1-GGGK-NC-FITC（圖2Ih）處理后未觀察到綠色熒光，作為陰性對照。使用ImageJ軟件計算細胞核的平均熒光強度為校正后的總細胞熒光，揭示了SW480和HCT116細胞系中相似的分布模式，共定位系數分別為0.83和0.75（圖2IIa-h，IIIa-h）。正如預期的那樣，在MDA-MB-231腫瘤細胞中幾乎沒有檢測到V-1-GGGK-FITC和V-1-GGGK-NC-FITC的綠色熒光信號（圖2 IVa-h）。這些結果為進一步探索肽V-1-GGGK在CRC腫瘤中的體內靶向能力提供了依據。
