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長余輝成像利用長余輝探針在光照停止后緩慢釋放出的光子對生物標(biāo)志物進行分析，可以有效避免外加激發(fā)光實時激發(fā)所產(chǎn)生的生物組織背景信號干擾。因此，相比于熒光成像，長余輝成像往往可以獲得更高的信背比、成像深度及檢測靈敏度。然而，在生物體系中，探針的長余輝信號強度易受到其濃度差異與余輝信號衰減等因素的影響，導(dǎo)致僅依賴于單通道長余輝信號強度的成像分析方法會降低目標(biāo)物檢測的可靠性，產(chǎn)生假陽/陰性的診斷結(jié)果。

為了克服這一不足，近日，南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院葉德舉教授與南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院毛亮教授、南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院馮敏主任合作，提出了基于“能量分流”的比率型長余輝探針構(gòu)建策略。該策略利用長余輝發(fā)光底物AG-8，在長余輝引發(fā)劑ZnPht作用后轉(zhuǎn)化為激發(fā)態(tài)AG-8*，接著發(fā)生“能量分流”過程，具體包含了（1）AG-8*與ZnPht之間的部分“長余輝共振能量轉(zhuǎn)移”（afterglow resonance energy transfer, ARET），（2）ZnPht與近紅外熒光染料Cy5.5以及（3）Cy5.5與猝滅劑QSY21之間級聯(lián)的三步能量轉(zhuǎn)移過程。這一“能量分流”過程可以得到520 nm處長余輝信號“常亮”輸出通道（AGL₅₂₀）和710 nm處長余輝信號被酶“激活”的輸出通道（AGL₇₁₀），從而產(chǎn)生雙通道長余輝信號，實現(xiàn)酶活性激活的比率長余輝（AGL₇₁₀/AGL₅₂₀）成像分析。

作者以金屬基質(zhì)蛋白酶-2（metalloproteinase-2， MMP-2）為例，構(gòu)建了可靶向αvβ3整合素、MMP-2激活的比率型長余輝成像探針RAG-RGD，應(yīng)用于活體腦膠質(zhì)瘤的成像分析。為了探究探針的比率檢測性能，作者首先構(gòu)建無靶向單元的探針RAG，并通過體外溶液實驗驗證，RAG在MMP-2切割多肽底物前后，AGL₅₂₀一直處于“常亮”狀態(tài)；而近紅外通道的長余輝信號（AGL₇₁₀）只有在MMP-2切割多肽底物后才被“開啟”（~13 倍），由此使比率信號AGL₇₁₀/AGL₅₂₀發(fā)生了“從低到高”的轉(zhuǎn)變（~11倍）。作者接著構(gòu)建了可靶向人腦膠質(zhì)瘤細胞U87MG的比率長余輝探針RAG-RGD。細胞實驗結(jié)果顯示，U87MG細胞經(jīng)靶向探針RAG-RGD、 cRGD + RAG-RGD及非靶向探針RAG分別孵育后，雖然在細胞中產(chǎn)生不同強度的AGL₅₂₀與AGL₇₁₀長余輝信號，但AGL₇₁₀/AGL₅₂₀的比率信號基本保持一致，而只有細胞經(jīng)過MMP-2抑制劑SB-3CT處理后，AGL₇₁₀/AGL₅₂₀才明顯下降。這一結(jié)果表明通過AGL₇₁₀/AGL₅₂₀比率成像，可有效排除細胞對探針攝取差異造成的單通道長余輝信號差異，從而對細胞水平的MMP-2活性進行準(zhǔn)確評估。

得益于長余輝探針RAG-RGD具有的優(yōu)異的成像信背比與成像深度（~ 0.8 cm），作者接著在活體層面考察了RAG-RGD對MMP-2檢測的性能。在皮下U87-MG腫瘤模型中，探針RAG-RGD仍然可以發(fā)揮比率的自校準(zhǔn)功能，排除因腫瘤對探針攝取差異而產(chǎn)生的干擾，對活體腫瘤的MMP-2活性進行精準(zhǔn)區(qū)分。作者進一步考察了RAG-RGD在原位腦膠質(zhì)瘤模型中的成像性能。結(jié)果顯示，RAG-RGD通過尾靜脈注射進入荷瘤小鼠體內(nèi)后，其在腫瘤的攝取隨著原位腫瘤尺寸的增大（腫瘤尺寸以生物發(fā)光信號（bioluminescence, BL）為指示）而增加，導(dǎo)致AGL₅₂₀與AGL₇₁₀的各自長余輝信號隨之增強。然而，比率信號AGL₇₁₀/AGL₅₂₀卻隨著腫瘤尺寸的增加而減弱，并保持良好的負相關(guān)性。這一實驗結(jié)果證實了比率長余輝探針RAG-RGD在活體成像中具有的良好自校準(zhǔn)優(yōu)勢，即排除腫瘤大小對探針蓄積量的影響與假陽性信號。比率成像結(jié)果驗證了MMP-2的活性在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，隨腫瘤尺寸的增加而減小。這種比率信號與腫瘤大小之間的負相關(guān)性，預(yù)示著長余輝比率成像可以更好地對微小腫瘤灶進行示蹤。

總之，在這項工作中，研究團隊創(chuàng)新性地提出了“能量分流”的策略，應(yīng)用于構(gòu)建MMP-2激活的比率型長余輝探針RAG-RGD。借助長余輝成像具有的高信背比、高成像深度與高靈敏度的優(yōu)勢以及比率分析具有的自校準(zhǔn)功能，RAG-RGD可以在皮下腫瘤和原位腦膠質(zhì)瘤模型中對MMP-2的活性進行成像，有效排除了假陽性信號的干擾，提升了體內(nèi)MMP-2活性分析的可靠性。借助以上優(yōu)勢， RAG-RGD通過長余輝比率成像證實了MMP-2的活性與腦膠質(zhì)瘤尺寸之間的負相關(guān)性，這有利于對早期的小尺寸腫瘤灶進行檢測。由于探針的響應(yīng)底物可靈活變換，因此，該工作提出的“能量分流”策略將可作為比率型長余輝成像探針構(gòu)建的通用性平臺，應(yīng)用于不同生物分子的長余輝比率成像分析。