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長(zhǎng)余輝成像利用長(zhǎng)余輝探針在光照停止后緩慢釋放出的光子對(duì)生物標(biāo)志物進(jìn)行分析，可以有效避免外加激發(fā)光實(shí)時(shí)激發(fā)所產(chǎn)生的生物組織背景信號(hào)干擾。因此，相比于熒光成像，長(zhǎng)余輝成像往往可以獲得更高的信背比、成像深度及檢測(cè)靈敏度。然而，在生物體系中，探針的長(zhǎng)余輝信號(hào)強(qiáng)度易受到其濃度差異與余輝信號(hào)衰減等因素的影響，導(dǎo)致僅依賴于單通道長(zhǎng)余輝信號(hào)強(qiáng)度的成像分析方法會(huì)降低目標(biāo)物檢測(cè)的可靠性，產(chǎn)生假陽(yáng)/陰性的診斷結(jié)果。

為了克服這一不足，近日，南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院葉德舉教授與南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院毛亮教授、南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院馮敏主任合作，提出了基于“能量分流”的比率型長(zhǎng)余輝探針構(gòu)建策略。該策略利用長(zhǎng)余輝發(fā)光底物AG-8，在長(zhǎng)余輝引發(fā)劑ZnPht作用后轉(zhuǎn)化為激發(fā)態(tài)AG-8*，接著發(fā)生“能量分流”過(guò)程，具體包含了（1）AG-8*與ZnPht之間的部分“長(zhǎng)余輝共振能量轉(zhuǎn)移”（afterglow resonance energy transfer, ARET），（2）ZnPht與近紅外熒光染料Cy5.5以及（3）Cy5.5與猝滅劑QSY21之間級(jí)聯(lián)的三步能量轉(zhuǎn)移過(guò)程。這一“能量分流”過(guò)程可以得到520 nm處長(zhǎng)余輝信號(hào)“常亮”輸出通道（AGL₅₂₀）和710 nm處長(zhǎng)余輝信號(hào)被酶“激活”的輸出通道（AGL₇₁₀），從而產(chǎn)生雙通道長(zhǎng)余輝信號(hào)，實(shí)現(xiàn)酶活性激活的比率長(zhǎng)余輝（AGL₇₁₀/AGL₅₂₀）成像分析。

作者以金屬基質(zhì)蛋白酶-2（metalloproteinase-2， MMP-2）為例，構(gòu)建了可靶向αvβ3整合素、MMP-2激活的比率型長(zhǎng)余輝成像探針RAG-RGD，應(yīng)用于活體腦膠質(zhì)瘤的成像分析。為了探究探針的比率檢測(cè)性能，作者首先構(gòu)建無(wú)靶向單元的探針RAG，并通過(guò)體外溶液實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，RAG在MMP-2切割多肽底物前后，AGL₅₂₀一直處于“常亮”狀態(tài)；而近紅外通道的長(zhǎng)余輝信號(hào)（AGL₇₁₀）只有在MMP-2切割多肽底物后才被“開(kāi)啟”（~13 倍），由此使比率信號(hào)AGL₇₁₀/AGL₅₂₀發(fā)生了“從低到高”的轉(zhuǎn)變（~11倍）。作者接著構(gòu)建了可靶向人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87MG的比率長(zhǎng)余輝探針RAG-RGD。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，U87MG細(xì)胞經(jīng)靶向探針RAG-RGD、 cRGD + RAG-RGD及非靶向探針RAG分別孵育后，雖然在細(xì)胞中產(chǎn)生不同強(qiáng)度的AGL₅₂₀與AGL₇₁₀長(zhǎng)余輝信號(hào)，但AGL₇₁₀/AGL₅₂₀的比率信號(hào)基本保持一致，而只有細(xì)胞經(jīng)過(guò)MMP-2抑制劑SB-3CT處理后，AGL₇₁₀/AGL₅₂₀才明顯下降。這一結(jié)果表明通過(guò)AGL₇₁₀/AGL₅₂₀比率成像，可有效排除細(xì)胞對(duì)探針攝取差異造成的單通道長(zhǎng)余輝信號(hào)差異，從而對(duì)細(xì)胞水平的MMP-2活性進(jìn)行準(zhǔn)確評(píng)估。

得益于長(zhǎng)余輝探針RAG-RGD具有的優(yōu)異的成像信背比與成像深度（~ 0.8 cm），作者接著在活體層面考察了RAG-RGD對(duì)MMP-2檢測(cè)的性能。在皮下U87-MG腫瘤模型中，探針RAG-RGD仍然可以發(fā)揮比率的自校準(zhǔn)功能，排除因腫瘤對(duì)探針攝取差異而產(chǎn)生的干擾，對(duì)活體腫瘤的MMP-2活性進(jìn)行精準(zhǔn)區(qū)分。作者進(jìn)一步考察了RAG-RGD在原位腦膠質(zhì)瘤模型中的成像性能。結(jié)果顯示，RAG-RGD通過(guò)尾靜脈注射進(jìn)入荷瘤小鼠體內(nèi)后，其在腫瘤的攝取隨著原位腫瘤尺寸的增大（腫瘤尺寸以生物發(fā)光信號(hào)（bioluminescence, BL）為指示）而增加，導(dǎo)致AGL₅₂₀與AGL₇₁₀的各自長(zhǎng)余輝信號(hào)隨之增強(qiáng)。然而，比率信號(hào)AGL₇₁₀/AGL₅₂₀卻隨著腫瘤尺寸的增加而減弱，并保持良好的負(fù)相關(guān)性。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了比率長(zhǎng)余輝探針RAG-RGD在活體成像中具有的良好自校準(zhǔn)優(yōu)勢(shì)，即排除腫瘤大小對(duì)探針蓄積量的影響與假陽(yáng)性信號(hào)。比率成像結(jié)果驗(yàn)證了MMP-2的活性在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，隨腫瘤尺寸的增加而減小。這種比率信號(hào)與腫瘤大小之間的負(fù)相關(guān)性，預(yù)示著長(zhǎng)余輝比率成像可以更好地對(duì)微小腫瘤灶進(jìn)行示蹤。

總之，在這項(xiàng)工作中，研究團(tuán)隊(duì)創(chuàng)新性地提出了“能量分流”的策略，應(yīng)用于構(gòu)建MMP-2激活的比率型長(zhǎng)余輝探針RAG-RGD。借助長(zhǎng)余輝成像具有的高信背比、高成像深度與高靈敏度的優(yōu)勢(shì)以及比率分析具有的自校準(zhǔn)功能，RAG-RGD可以在皮下腫瘤和原位腦膠質(zhì)瘤模型中對(duì)MMP-2的活性進(jìn)行成像，有效排除了假陽(yáng)性信號(hào)的干擾，提升了體內(nèi)MMP-2活性分析的可靠性。借助以上優(yōu)勢(shì)， RAG-RGD通過(guò)長(zhǎng)余輝比率成像證實(shí)了MMP-2的活性與腦膠質(zhì)瘤尺寸之間的負(fù)相關(guān)性，這有利于對(duì)早期的小尺寸腫瘤灶進(jìn)行檢測(cè)。由于探針的響應(yīng)底物可靈活變換，因此，該工作提出的“能量分流”策略將可作為比率型長(zhǎng)余輝成像探針構(gòu)建的通用性平臺(tái)，應(yīng)用于不同生物分子的長(zhǎng)余輝比率成像分析。