分享一篇近期發(fā)表在Nature Communications上的文章，題目為“Location-agnostic site-specific protein bioconjugation via Baylis Hillman adducts”。文章的通訊作者為印度博帕爾科學(xué)教育與研究所的Dimpy Kalia。
蛋白質(zhì)N-末端半胱氨酸（N-Cys）獨特的反應(yīng)性對選擇性蛋白質(zhì)標(biāo)記具有重要意義。此前，作者報道了衍生的Baylis Hillman加合反應(yīng)與1,2-氨基硫醇之間的快速選擇性反應(yīng)，以形成雙雜環(huán)支架，并將其用于體外和活細(xì)胞條件下穩(wěn)定的蛋白質(zhì)生物偶聯(lián)。作者將這種蛋白質(zhì)生物偶聯(lián)技術(shù)稱為Baylis Hillman orchestrated protein aminothiol labelling （BHoPAL）。此外，作者還報道了一種基于硫辛酸連接酶的技術(shù)，用于在蛋白質(zhì)內(nèi)任意位點引入1,2-氨基硫醇部分，使 BHoPAL技術(shù)應(yīng)用不局限于N-Cys，從而與位置無關(guān)。將這種方法與BHoPAL聯(lián)用，生成了雙標(biāo)記的蛋白質(zhì)生物偶聯(lián)物，即在單個蛋白質(zhì)分子的兩個不同特定位點上附加了不同的標(biāo)記（圖1）。
圖1. 用于蛋白質(zhì)中1,2-氨基硫醇化學(xué)選擇性生物偶聯(lián)的BHoPAL（Baylis Hillman orchestrated protein aminothiol labelling）策略。
靛紅衍生的 Baylis Hillman（IBH）反應(yīng)已被用作合成復(fù)雜天然產(chǎn)物的支架、醫(yī)藥中間體和臨床藥品的研究，盡管對IBH進(jìn)行了廣泛的研究，但它們與1,2-氨基硫醇的反應(yīng)性尚未報道。作者設(shè)想IBH中有兩個適當(dāng)定位的離去基團(tuán)，一個α-乙酸基團(tuán)和一個β-氰基團(tuán)，將與1,2-氨基硫醇進(jìn)行兩次連續(xù)的加成-消除反應(yīng)，以生成6元環(huán)狀加合物（圖2）。該反應(yīng)將涉及初始硫醇添加，然后消除乙酸鹽以生成中間體 B，然后進(jìn)行分子內(nèi)氮雜-邁克爾加成，然后消除氰基形成2，由于分子內(nèi)2中的烯烴將被鎖定在Z構(gòu)象中，使該反應(yīng)具有高度的Z選擇性（圖 2）。作者合成了N-乙酰的IBH加合物1并在堿性條件在室溫下，在質(zhì)子有機溶劑和非質(zhì)子有機溶劑以及水溶液中反應(yīng)，驗證了上述假設(shè)。
圖2. 通過IBH加合物介導(dǎo)的1,2-氨基硫醇衍生化合成C=C連接的雙雜環(huán)。
首先，作者用N -酰基IBH加合物1A和1B在不同pH條件下用等摩爾量的半胱胺·鹽酸處理，在高pH條件下反應(yīng)的更快(圖3a)。用烷基取代N -酰基會減慢與N -甲基加合物1c的反應(yīng)。接下來，作者研究了從n -乙酰半胱氨酸(NAC)開始的20種蛋白質(zhì)原氨基酸對1,2氨基硫醇片段的選擇性，均具有不錯的產(chǎn)率(圖3b)， N-甲基加合物1C也得到了類似的結(jié)果?；诎腚装彼岷?/span>1A在pH值為6、7、7.5和8的水溶液中的反應(yīng)的紫外光譜的動力學(xué)分析，計算出他們的二級速率常數(shù) (圖3c)。建立了BHoPAL對1,2-氨基硫醇的優(yōu)異化學(xué)選擇性。
圖3. 水溶液條件下N -?；?/span>/烷基IBH加合物與半胱氨酸的快速定量偶聯(lián)。
接下來，作者使用BHoPAL標(biāo)記蛋白質(zhì)的N-Cys殘基。構(gòu)建了三種N-Cys模型蛋白的，增強型綠色熒光蛋白(eGFP)、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)和mCherry，通過重組生產(chǎn)這些蛋白，將它們?nèi)诤系綗煵菸g刻病毒(TEV)蛋白酶底物肽(ENLYFQC序列)的N端，并進(jìn)行TEV蛋白酶裂解(圖4)。用等量的N -乙酰基IBH加合物1A、1D和1E在pH 6.5的磷酸鈉緩沖液中處理所得的N-Cys蛋白，通過ESI-MS分析，所有9種蛋白偶聯(lián)物均可得到，產(chǎn)率高達(dá)99%(圖4)。這些結(jié)果確定了對蛋白質(zhì)內(nèi)部半胱氨酸的N-半胱氨酸的選擇性。作者發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)生物偶聯(lián)物是穩(wěn)定的，并保留了未修飾的前體蛋白的結(jié)構(gòu)和功能特性。這些結(jié)果表明，在溫和的生物相容性條件下，BHoPAL在低試劑濃度下快速定量進(jìn)行，而不會破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能以形成穩(wěn)定的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物。
圖4. 通過BHoPAL標(biāo)記含N-Cys 的蛋白質(zhì)。
