推薦一篇發(fā)表在Analytical Chemistry上的文章，題目為“Electron-Activated Dissociation and Collision-Induced Dissociation Glycopeptide Fragmentation for Improved Glycoproteomics”，通訊作者是來自澳大利亞昆士蘭大學(xué)的Benjamin L. Schulz教授，主要研究方向是蛋白質(zhì)糖基化。
串聯(lián)質(zhì)譜與液相色譜法聯(lián)用(LC-MS/MS)已是鑒定和定量蛋白質(zhì)及其翻譯后修飾(post-translational modifications, PTMs)的通用工具。蛋白質(zhì)糖基化關(guān)系到蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和多種生物學(xué)功能，但目前對蛋白位點特異性糖基化的全面表征仍然存在挑戰(zhàn)性。碰撞誘導(dǎo)解離(Collision-induced dissociation, CID)是LC-MS/MS工作流程中最常用的碎片化方法，但是不穩(wěn)定修飾的缺失使得CID不適合用于表征位點特異性的糖基化?；陔娮拥慕怆x方法可以作為CID的替代，電子激活解離(Electron-activated dissociation, EAD)是其中一種。EAD能保留完整的糖肽片段以進行明確的位點定位，但與CID相比，碎裂時間較長和效率較低。這篇文章中，作者使用了ZenoTOF 7600 SCIEX來比較各種碎片化技術(shù)的性能，以分析哺乳動物O-和N-糖肽的復(fù)雜混合物，發(fā)現(xiàn)CID方法能鑒定出最多的糖肽，譜圖質(zhì)量更高，但EAD在糖基化位點定位方面提供了更高的置信度。于是他們用CID方法補充EAD (EAciD)增加了糖肽鑒定的數(shù)量和質(zhì)量，同時保持了定位的可信度。CID模式導(dǎo)致分子內(nèi)最弱的共價鍵優(yōu)先斷裂，因此，斷裂優(yōu)先發(fā)生在糖苷鍵而不是肽段的酰胺鍵上。因此，糖肽CID譜含有豐富的關(guān)于聚糖的信息，與相對較少的關(guān)于肽的信息。盡管如此，CID允許較快的掃描速度，但缺乏肽片段離子使得糖基化位點定位困難。EAD技術(shù)利用電子產(chǎn)生自由基，誘導(dǎo)較強的酰胺鍵斷裂，使肽主鏈優(yōu)先被碎裂，因此能更好地對修飾進行定位，而幾乎不產(chǎn)生糖苷鍵的碎裂結(jié)果。然而，EAD碎裂方法利用電子，會改變片段的帶電狀態(tài)，容易產(chǎn)生中性片段而使檢測強度降低，EAD方法對具有較大的負電荷聚糖或具有較低電荷狀態(tài)的前體糖肽的鑒定效率較低。EAD碎裂方法所需的時間也比CID時間長。
因此，在這篇文章中，作者利用人類A549細胞中獲取的糖肽樣本，首先對EAD碎裂的參數(shù)進行了優(yōu)化，包括射頻(radio frequency, RF)、電子束電流、電子動能(kinetic energy, KE)和碎裂時間，最終選擇KE為8 eV，碎裂時間為20 ms，RF為200 Da，電子束電流為5000 nA，以獲得高質(zhì)量的MS/MS譜。接下來，作者對四種碎裂方法進行了分析：CID，EAD以及兩種結(jié)合了CID以及EAD的EAciD方法。EAciD方法具有兩種不同水平的CID補充，均基于由前體離子m/z和電荷狀態(tài)確定的滾動CE方程。第一個EAciD方法(默認(rèn)EAciD)使用標(biāo)準(zhǔn)滾動CE方程。第二種方法(低能EAciD)使用梯度降低50%的調(diào)整的滾動CE方程。他們對每種方法的糖肽譜匹配進行了主成分分析，發(fā)現(xiàn)每種方法具有魯棒且獨特的聚類。作者發(fā)現(xiàn)，使用CID和默認(rèn)EAciD方法，O-糖肽鑒定的相對比例較高，雖然EAD和低能量EAciD方法鑒定數(shù)目較少，但與CID相比，它們并沒有偏向于特定類別的糖肽鑒定。與CID和默認(rèn)EAciD相比，EAD和低能EAciD方法傾向于識別具有較高電荷態(tài)的糖肽。作者比較了糖肽鑒定的分布及其相關(guān)的譜圖得分，發(fā)現(xiàn)默認(rèn)的EAciD模式具有較高的譜圖質(zhì)量以及鑒定數(shù)目。Byonic提供的“delta mod”分?jǐn)?shù)是衡量肽修飾定位置信度的一個指標(biāo)，分?jǐn)?shù)> 10.0表示修飾被正確定位的可能性很高。作者測試了CID, EAD和EAciD方法的性能，發(fā)現(xiàn)所有基于EAD的方法都優(yōu)于CID。總之， 作者利用EAciD組合CID和EAD方法提供了信息高度豐富的糖肽MS/MS譜，增加了糖肽鑒定的數(shù)量和質(zhì)量，同時保持了定位的可信度。原文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.4c01450原文引用：DOI: 10.1021/acs.analchem.4c01450
