為大家介紹的是最近在Journal of the American Chemical Society 上報道的一篇標(biāo)題為 “Site-Specific Antibody Prodrugs via S?Arylation: a Bioconjugation Approach Toward Masked Tyrosine Analogues” 的文章。該文的通訊作者是麻省理工學(xué)院化學(xué)系的Stephen L. Buchwald教授、Bradley L. Pentelute教授和百時美施貴寶研發(fā)部門的Yong Zhang。本文開發(fā)了一種抗體前藥的設(shè)計方法，能夠在目標(biāo)抗體的互補(bǔ)決定區(qū)中引入掩蔽基團(tuán)以減少抗體在正常組織中的脫靶毒性。并能在特定條件下脫保護(hù)變?yōu)橐环N酪氨酸模擬物，羥苯基半胱氨酸，基本維持原抗體的抗原結(jié)合活性。
抗體在包括癌癥在內(nèi)的多種人類疾病的治療中有著里程碑式的應(yīng)用意義，尤其是近年來逐漸興起的腫瘤免疫療法。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4（CTLA-4）在T細(xì)胞的識別和免疫抑制過程中起到重要作用，是腫瘤細(xì)胞逃逸免疫系統(tǒng)殺傷的重要受體之一。用抗體來阻斷CTLA-4與其配體的相互作用能夠激活免疫系統(tǒng)，并允許T細(xì)胞殺死相關(guān)的細(xì)胞。然而，與許多抗體治療藥物一樣，這一靶蛋白存在于病變和健康組織中，這可能通過與非腫瘤相關(guān)的CTLA-4相互作用導(dǎo)致腫瘤外毒性。因此，利用抗體前藥的策略，使抗體在目標(biāo)區(qū)域的刺激條件（如蛋白酶表達(dá)）下激活并恢復(fù)抗原結(jié)合能力，能夠有效降低其毒性，并擴(kuò)大治療窗口。
現(xiàn)有的抗體前藥制備策略主要集中于通過融合表達(dá)的方式在抗體的N端或C端添加掩蔽組件，但這種策略只將可掩蔽殘基限制在20種天然氨基酸中。在抗體側(cè)鏈進(jìn)行修飾能夠更有效地阻斷其與抗原的結(jié)合，并且能夠廣泛添加反應(yīng)位點(diǎn)，使響應(yīng)類型多樣化。此前作者團(tuán)隊研究過鈀催化的半胱氨酸芳基化反應(yīng)，并且驗證了產(chǎn)物與酪氨酸結(jié)構(gòu)和功能上的相似性。因此，在本文中，作者以CTLA-4的FDA批準(zhǔn)抗體藥物伊匹木單抗作為研究對象，用鈀催化的氧化加成反應(yīng)在其半胱氨酸側(cè)鏈上引入功能化芳基，實現(xiàn)了用蛋白酶可切割序列連接的PEG鏈對抗體結(jié)合能力的掩蔽。 (圖1)
圖1. 通過半胱氨酸的鈀催化芳基化偶聯(lián)獲得抗體前藥的方法。 首先，作者團(tuán)隊嘗試在伊匹木單抗的側(cè)鏈上突變酪氨酸為半胱氨酸，在這些半胱氨酸上用優(yōu)化的流程開展鈀催化的氧化反應(yīng)，成功在Y32C和Y49C兩個位點(diǎn)上引入了芳基連接子。經(jīng)過純化，質(zhì)譜結(jié)果證實了芳香連接子被添加在了輕鏈而非重鏈上，而且MS/MS二級質(zhì)譜結(jié)果也證明了在半胱氨酸殘基的位置有唯一的修飾。并且該羥苯基半胱氨酸（HPC）突變的伊匹木單抗與野生型的抗體有相當(dāng)?shù)目乖Y(jié)合能力。(圖2)圖2. 鈀催化的半胱氨酸芳基化特異性地發(fā)生在引入半胱氨酸殘基的伊匹木單抗上，具有良好的轉(zhuǎn)化率。 在驗證了該反應(yīng)能夠在伊匹木單抗上引入HPC保護(hù)基后，作者團(tuán)隊開始研究通過這個反應(yīng)引入掩蔽基團(tuán)的可能性。最終選擇能夠通過空間效應(yīng)減少結(jié)合，并增加蛋白血清半衰期的聚乙二醇作為掩蔽基團(tuán)。他們通過四步合成了帶有5k分子量PEG和LSGK間質(zhì)蛋白酶（Matr）酶切序列的鈀氧化加成復(fù)合物。通過SDS-PAGE驗證了輕鏈上聚乙二醇的成功偶聯(lián)以及在Matr處理下的成功脫籠。(圖3)圖3. 利用聚乙二醇掩蔽基團(tuán)遮蓋伊匹木單抗的抗原結(jié)合活性并實現(xiàn)腫瘤特異性酶切脫籠。 接下來，作者團(tuán)隊進(jìn)行了初步的細(xì)胞實驗，以說明PEG-HPC成功掩蔽了抗體與抗原的結(jié)合作用。通過FACS驗證了與Jurkat細(xì)胞的結(jié)合，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過掩蔽，其結(jié)合效力下降了約47倍，而酶切脫籠后則基本恢復(fù)野生型水平。SPR結(jié)合能力測定也佐證了PEG有強(qiáng)效的掩蔽作用，證明了在抗體前藥的制備過程中，大位阻基團(tuán)的掩蔽是有效的。(圖4)圖4. 掩蔽后的伊匹木單抗能顯著降低抗原結(jié)合活性。 綜上所述，該文章報道了一種新型抗體側(cè)鏈掩蔽手段，通過鈀催化氧化加成反應(yīng)，在半胱氨酸殘基上引入羥苯基，所獲產(chǎn)物與酪氨酸結(jié)構(gòu)和功能均相似。并且能夠通過該結(jié)構(gòu)引入腫瘤組織中的蛋白酶響應(yīng)序列，將PEG掩蔽基連接在抗原識別區(qū)上，實現(xiàn)強(qiáng)效的抗體功能掩蔽以及腫瘤特異性恢復(fù)。是一種全新的抗體前藥制備方法。DOI: 10.1021/jacs.4c04035Link: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.4c04035
