分享一篇發(fā)表在Bioconjugate Chemistry上的文章，標題為 “Oriented Antibody Coupling to an Antifouling Polymer Using Glycan Remodeling for Biosensing by Particle Motion”, 文章的通訊作者是來自埃因霍溫理工大學分子生物傳感應用系的Menno W.J. Prins教授；Menno W.J. Prins教授致力于開發(fā)在復雜的大分子環(huán)境（如血漿）中以單分子分辨率檢測蛋白質和研究蛋白質功能的技術。本文主要展示了一種實現(xiàn)抗體與聚（l-賴氨酸）-接枝聚（乙二醇）（PLL-g-PEG）基質定向偶合的方法，利用聚糖重塑來創(chuàng)建抗體-DNA共軛物。
在本文中，作者開發(fā)了一種策略，在聚合物上實現(xiàn)定向抗體偶聯(lián)，以實現(xiàn)連續(xù)生物傳感目的。
定向偶聯(lián)是通過重塑抗體聚糖產生抗體-ssDNA偶聯(lián)物來實現(xiàn)的，然后雜交到ssDNA偶聯(lián)到固體基質上的聚（l-賴氨酸）-接枝聚（乙二醇）（PLL-g-PEG）涂層上。在具有單分子分辨率的連續(xù)生物傳感技術中使用抗降鈣素原抗體來展示偶聯(lián)策略，稱為粒子運動生物傳感（BPM）。降鈣素原（PCT）是一種炎癥生物標志物，用于區(qū)分患者是否為細菌或病毒感染，并監(jiān)測患者抗生素治療后的反應。作者研究了抗體修飾方法和抗體取向，展示了抗體在BPM生物傳感器中的實現(xiàn)策略。本研究的目的是通過修飾聚糖并通過DNA連接到聚合物，以定向方式偶聯(lián)抗體。使用GlycoConnect（圖1）創(chuàng)建Ab-DNA偶聯(lián)物，使Fab位點完好無損。首先，用內切糖苷酶SH修剪聚糖，然后，UDP-GalNac6N3通過半乳糖基轉移酶（Y289L）與剩余的N-乙酰氨基葡萄糖相連。最后，通過DBCO-ssDNA與疊氮化物糖發(fā)生SPAAC點擊化學反應，實現(xiàn)了DNA與抗體的偶聯(lián)。將抗體固定在用聚合物PLL-g-PEG/N官能化的底物上，通過將DBCO-ssDNA與底物上的疊氮化物進行SPAAC點擊化學反應，然后使用兩條中間ssDNA鏈將Ab-DNA與底物上的DNA雜交，從而實現(xiàn)固定化（圖1）。首先使用曲妥珠單抗測試和優(yōu)化修飾策略，該修飾被應用于抗PCT抗體。曲妥珠單抗因為它的大量可用性被用于初始研究，并且其Fc片段與抗PCT抗體的Fc片段相似。使用液相色譜/質譜（LC-MS）和SDS-PAGE評估Ab修飾的產率。對于曲妥珠單抗的重塑，當將4 mol當量的DNA與Abs結合時，聚糖重塑率達到81%，Ab-DNA偶聯(lián)率達到65%?？?/span>PCT抗體修飾的結果如圖2所示。
接下來，根據(jù)Tholen等人最近發(fā)表的一種方法，使用蛋白質G和蛋白質M量化抗體在顆粒上的取向。作者將成像方法應用于與鏈霉親和素功能化二氧化硅顆粒偶聯(lián)的抗體，因為這些抗體在DNA-PAINT中具有良好的成像特性。將顆粒固定在底物上，并使用雙色DNA-PAINT對顆粒上抗體的可及Fab和Fc結構域進行成像。成像是通過用蛋白G-ssDNA偶聯(lián)物靶向Fc結構域和用蛋白M-ssDNA偶聯(lián)物靶向Fab結構域來實現(xiàn)的（圖3）。偶聯(lián)的ssDNA 鏈可作為對接鏈，用于DNA-PAINT成像。該成像技術利用染料標記的互補成像儀ssDNA鏈的瞬時結合和解結合，以納米級分辨率定位對接鏈的位置。用Cy3B（綠色）和ATTO-647N（紅色）染料對ssDNA成像鏈進行功能化，以便分別定位與蛋白質M和蛋白質G偶聯(lián)的對接鏈，以定量顆粒底物上暴露的Fab和Fc結構域的比例（圖3）。圖3 單分子DNA-PAINT研究與二氧化硅顆粒偶聯(lián)的抗體取向
接著以降鈣素原為模型進行研究，以顆粒運動生物傳感為讀出方法，研究了與PLL-g-PEG涂層偶聯(lián)的Ab-DNA偶聯(lián)物的生物傳感功能。在實驗中，使用暗視野顯微鏡跟蹤了數(shù)百個顆粒的運動，并根據(jù)其擴散率對顆粒進行了表征（圖4）。擴散率低（D < 0.15 μm2/s）的顆粒被表征為結合顆粒，而擴散率高（D > 0.15 μm2/s）的顆粒被表征為非結合顆粒。如圖1所示，采用夾心傳感器的形式，使用生物素化的Abs對顆粒進行功能化，使用Ab-DNA 共軛物對底物進行功能化。圖4 在基于粒子運動（BPM）的生物傳感器中研究抗體功能
最后通過比較兩種不同的底物功能化方法來評估非特異性結合的程度：雜交到聚苯乙烯PLL-g-PEG涂層上的定向Ab-DNA共軛物和吸附在玻璃上的非定向Abs物理吸附（圖4）。在BPM傳感器上測得的與PLL-g-PEG 上的Ab-DNA 共軛物和物理吸附的Abs的結合分數(shù)分別為0.12和0.26。對于含有Ab-DNA共軛物的傳感器，結合態(tài)的擴散直方圖顯示出三個峰的模式，隨著擴散率的增加，峰高也在增加，這表明一些粒子具有單分子鍵，而另一些粒子具有多分子鍵。物理吸附Abs的傳感器顯示出結合粒子的擴散率分布很廣，在擴散率為零時有一個明顯的高峰，表明許多粒子根本沒有運動。與物理吸附的Abs相比，與PLL-g-PEG雜交的Ab-DNA結合物底物顯示出較少的多價相互作用和非特異性相互作用。非特異性相互作用較少的原因可能是使用了防污PLL-g-PEG涂層。綜上所述，作者介紹了一種實現(xiàn)抗體與基底定向偶聯(lián)的偶聯(lián)方法，并使用降鈣素原免疫傳感器展示了其生物傳感功能。這種定向耦合是通過重塑抗體聚糖使其含有疊氮化物、通過SPAAC點擊化學連接ssDNA以及通過DNA雜交將抗體-DNA共軛物耦合到PLL-g-PEG底物上實現(xiàn)的。同時定向偶聯(lián)方法將成為設計新型抗體生物傳感器的靈活途徑。
文章作者：LT
DOI: 10.1021/acs.bioconjchem.4c00196
