褪黑素是一種由松果體分泌的激素，能夠調(diào)節(jié)人體的生理節(jié)律和睡眠。目前褪黑素在全球的需求量日益增加，其工業(yè)化生產(chǎn)主要以化學(xué)法合成為主，但存在原料成本不易獲得、污染環(huán)境、反應(yīng)路線長等缺點(diǎn)。作為替代方案，綠色高效的全酶法催化合成褪黑素受到廣泛關(guān)注。在酶法合成褪黑素的過程中，芳烷基胺N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（Arylalkylamine N-acetyltransferase，AANAT）的活性較低，從而會限制褪黑素合成的產(chǎn)量。作為褪黑素生物合成的關(guān)鍵限速酶，AANAT催化底物5-羥色胺（5-hydroxytryptamine）生成N-乙酰-5-羥色胺（N-acetyl-5-hydroxytryptamine）（圖1）。因此通過酶工程手段提高AANAT催化5-羥色胺的活性，具有重要的研究價(jià)值和科學(xué)意義。
圖1. N-乙酰轉(zhuǎn)移酶催化合成褪黑素前體。 本研究以一種家牛來源（Bos taurus）的N-乙酰轉(zhuǎn)移酶BtAANAT為模板開展進(jìn)化分析獲得系列新穎AANAT（圖2a），并經(jīng)實(shí)驗(yàn)測試發(fā)現(xiàn)歐亞野豬來源（Sus scrofa）的SsAANAT全細(xì)胞催化活性最高（圖2b）。以野生型SsAANAT為模板，經(jīng)過四輪理性迭代突變，成功獲得了一個(gè)三組合優(yōu)勢突變體M3（SsAANAT-P58S/T62E/V138I）（圖2c）。與野生型SsAANAT相比，最優(yōu)突變體M3的全細(xì)胞催化活性從50%提高到99%。此外，在熱穩(wěn)定性沒有明顯損失的同時(shí)（Tm > 45 °C），M3的催化效率（kcat/Km）也提高了2倍。為了測試AANAT催化5-羥色胺生成N-乙酰-5-羥色胺的工業(yè)應(yīng)用潛力，本研究測試了10 mL體系中，全細(xì)胞催化50 mM底物5-羥色胺的放大反應(yīng)。結(jié)果顯示，在30小時(shí)內(nèi)其轉(zhuǎn)化率可達(dá)到99%（圖2d）。 圖2. N-乙酰轉(zhuǎn)移酶新酶挖掘測試及迭代突變。 此外，本研究還利用分子動力學(xué)模擬揭示了優(yōu)勢突變體M3（SsAANAT-P58S/T62E/V138I）活性提高的原因，其中58和62位點(diǎn)的突變通過改變環(huán)區(qū)的靈活性來影響酶的催化活性，138位點(diǎn)對輔因子結(jié)合的能量貢獻(xiàn)較大。因此，突變體M3通過改變與底物5-羥色胺和輔因子AcCoA新形成或增強(qiáng)的相互作用，從而提高了催化活性。 圖3. 利用分子動力學(xué)模擬分析最優(yōu)突變體M3活性提升的分子機(jī)制。 綜上，該工作為通過蛋白質(zhì)工程手段提高AANAT的活性奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也拓寬了乙?；胚峄衔锏纳锎呋瘧?yīng)用工具箱，為進(jìn)一步設(shè)計(jì)同類型AANATs作為褪黑素生物合成的催化劑提供了有益的啟示。 論文信息 Engineering the Activity of a Newly Identified Arylalkylamine N-Acetyltransferase in the Acetylation of 5-Hydroxytryptamine Qing Wang, Congcong Li, Prof. Bo Yuan, Prof. Aiqun Yu, Prof. Ge Qu, Prof. Zhoutong Sun 該研究工作得到了國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃等項(xiàng)目支持。中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所曲戈副研究員和孫周通研究員為論文共同通訊作者。 ChemBioChem DOI: 10.1002/cbic.202400069
