分享一篇發(fā)表在JACS上的文章“In Situ Biofilm Affinity-Based Protein Profiling Identifies the Streptococcal Hydrolase GbpB as the Target of a Carolacton-Inspired Chemical Probe”，通訊作者是來(lái)自美國(guó)埃默里大學(xué)化學(xué)系的William M. Wuest，他的主要研究方向是抗菌天然產(chǎn)物及其作用機(jī)制。
天然產(chǎn)物是抗生素藥物設(shè)計(jì)的重要前體，這些分子作為化學(xué)支架為化學(xué)家提供了合成靈感，可以利用其結(jié)構(gòu)來(lái)開(kāi)發(fā)新型抗菌劑和化學(xué)探針。Carolacton 是由 Sorangium cellulosum 生物合成的天然產(chǎn)物，已被證明會(huì)影響變形鏈球菌的碳利用、細(xì)胞壁生物合成、氨基酸代謝和生物膜形成，對(duì)肺炎鏈球菌也存在抑菌效果，說(shuō)明該分子可能在鏈球菌中存在保守的互作靶標(biāo)。在作者實(shí)驗(yàn)室過(guò)去的工作中，通過(guò)分流全合成（Diverted Total Synthesis, DTS）的方法，他們簡(jiǎn)化了Carolacton，獲得了其類(lèi)似物（A2），實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有比天然分子更好的生長(zhǎng)抑制和抗生物膜活性，但其作用的生物靶點(diǎn)尚不清楚。
因此在本文中，作者以Carolacton的類(lèi)似物A2為化學(xué)支架，在末端羧基上酰胺化衍生，合成了帶有光交聯(lián)基團(tuán)雙吖丙啶和富集基團(tuán)炔基的探針（A2-PP）。在標(biāo)記實(shí)驗(yàn)時(shí)，作者設(shè)計(jì)了兩組條件，分別在微生物生物膜（Biofilm）合成早期以及生物膜成熟時(shí)期進(jìn)行探針標(biāo)記，紫外照射后收集生物膜，裂解獲取蛋白，用羅丹明-疊氮或生物素-疊氮即可富集用于熒光膠或質(zhì)譜分析。SDS-PAGE的結(jié)果顯示，在變形鏈球菌生物膜發(fā)育期進(jìn)行標(biāo)記時(shí)富集到的蛋白信號(hào)更為顯著，這與抑制實(shí)驗(yàn)的表型一致。隨后，作者設(shè)置濃度梯度，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記濃度在1-5 μM時(shí)較好。隨后，作者分析了質(zhì)譜數(shù)據(jù)，與DMSO對(duì)照組相比進(jìn)行無(wú)標(biāo)定量分析，要求靶標(biāo)在1 μM A2-PP處理時(shí)要有標(biāo)記，且濃度提升到5μM A2-PP標(biāo)記時(shí)表現(xiàn)出劑量依賴性富集。最終篩選出了3個(gè)靶標(biāo)，其中GbpB的劑量依賴性富集效果最明顯。
作者通過(guò)過(guò)表達(dá)和體外純化實(shí)驗(yàn)證實(shí)了GbpB與A2-PP和A2的結(jié)合。且由于研究者對(duì)于GbpB在細(xì)菌生長(zhǎng)中的作用知之甚少，因此作者通過(guò)序列分析將目光轉(zhuǎn)向了其同系物——來(lái)自肺炎鏈球菌的PcsB，該蛋白表征結(jié)果較多且具有已解析的晶體結(jié)構(gòu)。作者證實(shí)了A2分子與PcsB也具有較明顯的結(jié)合作用。通過(guò)將PcsB晶體結(jié)構(gòu)與GbpB在AlphaFold2中的預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)它們確實(shí)具有高度同源性。因此，作者對(duì)接計(jì)算預(yù)測(cè)了PcsB與A2的相互作用位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)A2主要與保守的 C 端 CHAP（Cysteine, histidine-dependent, amidohydrolase/peptidase）結(jié)構(gòu)域結(jié)合，也是該結(jié)構(gòu)域報(bào)道的第一個(gè)小分子結(jié)合劑。總的來(lái)說(shuō)，本文揭示了天然產(chǎn)物Carolacton衍生的化合物 A2 的蛋白質(zhì)靶標(biāo)，并通過(guò)對(duì)其同源蛋白的分析揭示了蛋白-小分子結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)于抗菌分子A2的作用機(jī)制研究具有重要意義。文章鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.4c06658原文引用：DOI: 10.1021/jacs.4c06658
