分享一篇發(fā)表在JACS上的文章“In Situ Biofilm Affinity-Based Protein Profiling Identifies the Streptococcal Hydrolase GbpB as the Target of a Carolacton-Inspired Chemical Probe”，通訊作者是來自美國埃默里大學化學系的William M. Wuest，他的主要研究方向是抗菌天然產物及其作用機制。
天然產物是抗生素藥物設計的重要前體，這些分子作為化學支架為化學家提供了合成靈感，可以利用其結構來開發(fā)新型抗菌劑和化學探針。Carolacton 是由 Sorangium cellulosum 生物合成的天然產物，已被證明會影響變形鏈球菌的碳利用、細胞壁生物合成、氨基酸代謝和生物膜形成，對肺炎鏈球菌也存在抑菌效果，說明該分子可能在鏈球菌中存在保守的互作靶標。在作者實驗室過去的工作中，通過分流全合成（Diverted Total Synthesis, DTS）的方法，他們簡化了Carolacton，獲得了其類似物（A2），實驗證實其具有比天然分子更好的生長抑制和抗生物膜活性，但其作用的生物靶點尚不清楚。因此在本文中，作者以Carolacton的類似物A2為化學支架，在末端羧基上酰胺化衍生，合成了帶有光交聯(lián)基團雙吖丙啶和富集基團炔基的探針（A2-PP）。在標記實驗時，作者設計了兩組條件，分別在微生物生物膜（Biofilm）合成早期以及生物膜成熟時期進行探針標記，紫外照射后收集生物膜，裂解獲取蛋白，用羅丹明-疊氮或生物素-疊氮即可富集用于熒光膠或質譜分析。SDS-PAGE的結果顯示，在變形鏈球菌生物膜發(fā)育期進行標記時富集到的蛋白信號更為顯著，這與抑制實驗的表型一致。隨后，作者設置濃度梯度，發(fā)現(xiàn)標記濃度在1-5 μM時較好。隨后，作者分析了質譜數(shù)據(jù)，與DMSO對照組相比進行無標定量分析，要求靶標在1 μM A2-PP處理時要有標記，且濃度提升到5μM A2-PP標記時表現(xiàn)出劑量依賴性富集。最終篩選出了3個靶標，其中GbpB的劑量依賴性富集效果最明顯。作者通過過表達和體外純化實驗證實了GbpB與A2-PP和A2的結合。且由于研究者對于GbpB在細菌生長中的作用知之甚少，因此作者通過序列分析將目光轉向了其同系物——來自肺炎鏈球菌的PcsB，該蛋白表征結果較多且具有已解析的晶體結構。作者證實了A2分子與PcsB也具有較明顯的結合作用。通過將PcsB晶體結構與GbpB在AlphaFold2中的預測結構比對，發(fā)現(xiàn)它們確實具有高度同源性。因此，作者對接計算預測了PcsB與A2的相互作用位點，發(fā)現(xiàn)A2主要與保守的 C 端 CHAP（Cysteine, histidine-dependent, amidohydrolase/peptidase）結構域結合，也是該結構域報道的第一個小分子結合劑。總的來說，本文揭示了天然產物Carolacton衍生的化合物 A2 的蛋白質靶標，并通過對其同源蛋白的分析揭示了蛋白-小分子結合位點，對于抗菌分子A2的作用機制研究具有重要意義。文章鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.4c06658原文引用：DOI: 10.1021/jacs.4c06658
