分享一篇發(fā)表在Science Advance上的文章，題目為A ubiquitin-specific, proximity-based labeling approach for the identification of ubiquitin ligase substrates，通訊作者共兩位，分別為來自歐洲分子生物學實驗室（EMBL）的Sagar Bhogaraju研究員，和來自慕尼黑大學的Christian Behrends教授。Bhogaraju課題組主要研究泛素化修飾的分子機制，Behrends課題組則研究蛋白穩(wěn)態(tài)。
蛋白質泛素化修飾參與了幾乎所有細胞過程的動態(tài)調控。在E1、E2和E3的酶促級聯(lián)反應下，76 aa的泛素蛋白（Ub）通過異肽鍵與底物賴氨酸共價連接。在人體中，已知有2種E1泛素激活酶、~40種E2泛素偶聯(lián)酶以及>600種E3泛素連接酶共同實現(xiàn)了泛素化修飾的精細調控?；诮Y構的同源性，E3泛素連接酶可以分為RING、U-box、HECT、RBR多種蛋白家族。由于E3連接酶是泛素化修飾過程的決定性參與者，因此揭示E3泛素連接酶的底物譜對于深入了解其細胞和生理作用至關重要。在這里，研究人員開發(fā)了一種方法，可以直接在細胞中選擇性地、穩(wěn)健地標記特定E3 Ub連接酶的底物。基于對UbcH5A~Ub-RNF4、HECT NEDD4L~Ub這兩個E2~Ub-E3復合物的結構進行觀察，研究人員注意到E3泛素連接酶含催化結構域的蛋白末端與Ub的N末端具有保守的空間鄰近性，并且以相同的朝向暴露在溶劑中。作者設想，若將大腸桿菌生物素連接酶（BirA）表達在E3泛素連接酶的催化末端，同時在Ub的N末端表達BirA的“接受肽”（AP），當E2~Ub-E3復合物形成時，兩者具有空間與朝向的匹配性，BirA將能夠催化Ub上的AP序列發(fā)生生物素化。隨后，生物素化的AP-Ub 被轉移到底物蛋白上，從而可以使用鏈霉親和素富集以及蛋白質質譜技術對底物蛋白進行系統(tǒng)鑒定。研究人員首先在RING家族E3泛素連接酶RAD18上對上述概念進行驗證。已知在紫外線誘導的DNA損傷中，RAD18與E2泛素偶聯(lián)酶RAD6共同介導增殖細胞核抗原（PCNA）的單泛素化，從而引發(fā)跨損傷DNA合成過程。在UV處理后，可觀察到蛋白質組中生物素化水平顯著升高，同時，定量蛋白質組學分析也將PCNA鑒定為唯一顯著上調的修飾蛋白。上述結果均證實本文設計在鑒定E3連接酶底物上的可信性。隨后，研究人員對標記體系進行優(yōu)化。首先，考慮到AP與BirA的親和力較高，在不依賴于E2~Ub-E3復合物的存在下，游離AP-Ub即可發(fā)生直接的生物素化，最終帶來較高的標記背景。在此，作者證明AP截斷體能夠顯著降低標記背景，并最終選用(-2)AP-Ub進行后續(xù)實驗。泛素化是一種可逆共價修飾，可以被去泛素化酶（DUB）擦除。DUB的活性將導致生物素化的(-2)AP-Ub被循環(huán)利用，對底物鑒定的特異性和效率造成不利影響。通過使用廣譜DUB抑制劑PR619，研究人員提高了PCNA底物鑒定的置信度，同時得到了更多的潛在RAD18底物。研究人員將本文方法與BioID進行了比較。當僅在RAD18上融合表達BirA突變體時，基于相同的實驗條件能夠得到高達320個富集的潛在相互作用蛋白，其GO富集分析分類則集中在剪接體、轉錄因子，表明RAD18處于復雜的蛋白相互作用網(wǎng)絡中。此外，基于BioID技術所富集的蛋白與本文鑒定的潛在底物只有1個蛋白的重疊，進一步突出了本文方法在鑒定E3連接酶底物上的優(yōu)越性。為展示該方法的普適性，研究人員也將該體系應用于其他E3泛素連接酶中。作者揭示了短時NF-κB處理下，RING家族E3連接酶TRAF6的底物譜，并對含U-box結構域E3連接酶CHIP在蛋白質質量過程中的底物譜進行研究與驗證。原文鏈接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adp3000文章引用：10.1126/sciadv.adp3000
