分享一篇發(fā)表在Nature Chemical Biology上的文章“Endogenous cell membrane interactome mapping for the GLP-1 receptor in different cell types”，通訊作者是來自上海科技大學(xué)的水雯箐教授和莊敏教授，研究方向?yàn)橛H和質(zhì)譜和蛋白質(zhì)互作。在本文中，作者采用鄰近標(biāo)記策略探究了GLP-1受體的內(nèi)源性細(xì)胞膜相互作用組，并發(fā)現(xiàn)了該受體的新型互作蛋白。
胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）受體是一種B類GPCR，是治療II型糖尿病和肥胖癥最成功的藥物靶點(diǎn)之一，已知它與多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白結(jié)合。然而，對(duì)GLP-1受體如何與細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)相互作用的研究仍然較少。在本文中，作者發(fā)展了一種基于配體的鄰近標(biāo)記策略，用于研究在配體結(jié)合后GLP-1受體的相互作用蛋白。
首先，由于GLP是通過N端結(jié)構(gòu)域與GLP-1受體結(jié)合的，因此作者在C端上設(shè)計(jì)了兩種不同的偶聯(lián)過氧化酶的策略。其一是通過雙模塊偶聯(lián)，分別合成GLP-1-生物素和HRP-親和素；其二是單模塊純化，將APEX2融合在GLP-1的C端并在純化后切除tag。隨后作者評(píng)價(jià)了兩種偶聯(lián)策略對(duì)GLP-1激活能力的影響，他們發(fā)現(xiàn)與天然肽相比，GLP-1-APEX2 在引發(fā) cAMP 信號(hào)傳導(dǎo)方面顯示出相近的效果，而GLP-1-HRP則顯著降低。隨后，作者也通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)證明了在表達(dá)GLP-1受體的293T細(xì)胞中，GLP-1-APEX2所誘導(dǎo)的生物素化與受體共定位。
接下來，作者采用了GLP-1-APEX2分別處理胰島β細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞，并另外設(shè)置了PBS處理組、和GLP-1競(jìng)爭(zhēng)組，進(jìn)行三次生物學(xué)重復(fù)和DIA-MS定量。在胰島細(xì)胞中，作者鑒定到了294個(gè)顯著富集的膜蛋白，以及130個(gè)能夠被GLP-1競(jìng)爭(zhēng)的蛋白，這些蛋白來自GPCR、離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的多個(gè)成員。并且作者也發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)細(xì)胞中和胰島細(xì)胞中的互作蛋白差異較大。此外，作者也將實(shí)驗(yàn)結(jié)果與BioGRID數(shù)據(jù)庫中的124個(gè)推定的GLP-1受體互作蛋白進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)僅有4個(gè)重疊，他們認(rèn)為這是高度細(xì)胞類型特異性所導(dǎo)致的。另外作者也選擇了部分新型互作蛋白進(jìn)行了功能研究，發(fā)現(xiàn)其中GIPR, ATP1B3, SLC4A4 and GPC4與GLP-1受體的結(jié)合能夠抑制cAMP信號(hào)途徑起到調(diào)節(jié)胰島素釋放的作用。最終，作者也進(jìn)行了時(shí)間分辨的GLP-1受體的膜蛋白互作組研究。
總的來說，在本文中作者發(fā)展了一種基于配體的鄰近標(biāo)記策略，用于研究GLP-1受體與配體結(jié)合后的膜蛋白互作組，并發(fā)現(xiàn)了新型的GLP-1受體相互作用蛋白。
