多通道單分子檢測已經(jīng)在各個領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注，例如并行檢測生物標(biāo)志物、監(jiān)測多種分子的動態(tài)過程、多通道超分辨率成像、以及藥物發(fā)現(xiàn)和篩選等。現(xiàn)有的多通道檢測方法，主要是通過基于熒光技術(shù)的單通道串聯(lián)來實現(xiàn)的復(fù)用檢測，通?？梢詫崿F(xiàn)四通道的并行檢測，但對于更高需求的多重檢測則需要非常復(fù)雜的設(shè)計和配置，難以實現(xiàn)。同時，主流的檢測方法一般是通過對熒光點的計數(shù)來實現(xiàn)的定量檢測，在實際檢測中，容易受到基質(zhì)中熒光分子的干擾而產(chǎn)生假陽性信號，從而影響單分子計數(shù)結(jié)果的準確性等。因此，開發(fā)出一種能夠?qū)崿F(xiàn)多通道單分子檢測的定量分析成像方法在單分子檢測領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用潛力。在此，南方科技大學(xué)郝瑞課題組開發(fā)了一種定量的基于電化學(xué)熒光的成像方法，在碳化硅（SiC）納米薄膜修飾的氧化銦錫（ITO）透明電極上直接實現(xiàn)多通道單分子計數(shù)。作者利用該納米薄膜在較低的電位范圍內(nèi)通過質(zhì)子耦合電子轉(zhuǎn)移控制局部pH，在更高的電位下進一步誘導(dǎo)染料分子的直接電化學(xué)氧化，實現(xiàn)了在不同pH和氧化還原行為下的熒光-電化學(xué)調(diào)控。該方法實現(xiàn)了非信號放大的直接單分子計數(shù)，在皮摩爾范圍內(nèi)表現(xiàn)出優(yōu)異的線性響應(yīng)。成功區(qū)分七種混合的不同染料，突顯了其在高精度單分子檢測中的多功能性和有效性，為多通道單分子的平行檢測提供了新的研究思路。相關(guān)研究成果以“Multiplexed Fluoro-electrochemical Single-molecule Counting Enabled by SiC Semiconducting Nanofilm”為題發(fā)表在Nano Letters上。南方科技大學(xué)2022級博士生賀海涵為第一作者，郝瑞副教授為通訊作者。
圖1. 實驗裝置示意圖以及SiC納米薄膜的表征。作者首先在ITO表面通過磁控濺射制備40nm的SiC納米薄膜，SiC納米薄膜表面可以與大氣中的H2O和O2相互作用，形成HxSiyOz化合物結(jié)構(gòu)（圖1C），在還原和氧化過程中，該硅化合物表面分別釋放氫氧根離子或質(zhì)子，起到調(diào)控局部pH的效果，進一步起到調(diào)控染料分子熒光開關(guān)的作用。
圖2. 不同熒光染料（Cy3，ATTO 565，Alexa Fluor 546）在電化學(xué)調(diào)控下的機理以及原位電化學(xué)熒光光譜。通過循環(huán)伏安掃描，作者觀察到不同結(jié)構(gòu)的熒光分子在不同電位下的電化學(xué)響應(yīng)。如圖2A所示，單個Cy3分子在?1V時表現(xiàn)為“on”狀態(tài)并顯示出強熒光，ATTO 565分子處于“off”狀態(tài)未顯示熒光，而Alexa Fluor 546分子處于“weak”狀態(tài)并顯示出弱的熒光。當(dāng)電位增加到1.6V時，ATTO 565和Alexa Fluor 546都轉(zhuǎn)變?yōu)?/span>“on”狀態(tài)， Cy3仍保持在“on”狀態(tài)。隨著電位的進一步升高，所有染料的熒光逐漸減弱，在3V時達到“off”狀態(tài)。熒光染料的開關(guān)機理與其結(jié)構(gòu)相關(guān)，主要分為以ATTO 565為代表的2-羧基羅丹明類染料和Cy3為代表的花菁類染料。其中ATTO 565在低電位下發(fā)生分子內(nèi)螺環(huán)化反應(yīng)，螺環(huán)化破壞了π共軛體系，從而關(guān)閉了熒光。隨著電位增加，局部質(zhì)子濃度迅速增加，導(dǎo)致螺環(huán)打開并恢復(fù)熒光。花菁類染料則不受此過程影響。在更高的氧化電位下，包括2-羧基羅丹明類和花菁類熒光染料在內(nèi)的所有熒光染料都會失去電子。其中，Alexa Fluor 546也屬于2-羧基羅丹明類染料，但是其在螺環(huán)化顯示出弱的熒光，其獨特的反應(yīng)可能是由于其分子結(jié)構(gòu)區(qū)別于其他2-羧基羅丹明染料。
圖3. 單分子水平下的熒光-電化學(xué)響應(yīng)以及線性動態(tài)范圍的收集接下來，作者進一步研究了單分子水平下染料的熒光-電化學(xué)響應(yīng)。對Cy3、ATTO 565和Alexa Fluor 546（圖3A–3C），隨機選擇了五個單分子并分別進行了研究（圖3D–3F），記錄了每個單分子染料的熒光-電化學(xué)響應(yīng)。結(jié)果表明，熒光-電化學(xué)的變化在所有單分子染料中都顯著可控且一致。類似的電化學(xué)響應(yīng)也在單個Cy2、Alexa Fluor 488、Cy5和Si-rhodamine分子中進行了研究。為了評估這種方法的準確性，作者對七種染料的進行了線性范圍的收集。Cy3和ATTO 565在1-100 pmol/L的范圍內(nèi)表現(xiàn)出線性動態(tài)范圍，Alexa Fluor 546在1-50 pmol/L的范圍內(nèi)表現(xiàn)出線性動態(tài)范圍（見圖3G）。檢測限的確定依賴于對單分子數(shù)量的計數(shù)。此外，Cy2、Alexa Fluor 488、Cy5和Si-rhodamine同樣在1-100 pmol/L的范圍內(nèi)表現(xiàn)出線性動態(tài)范圍。
圖4. 七種隨機混合的不同染料的識別和區(qū)分。如圖4所示，作者對七種染料進行隨機混合。采用488、561和640 nm波長的激光，間隔50 ms交替照射。圖4B顯示了不同電位下七種染料的響應(yīng)，清晰地辨別了每種分子對應(yīng)的具體目標(biāo)染料。在單次測試中，作者成功識別出了一個Cy2，一個Alexa Fluor 488，兩個Cy3，兩個ATTO 565，十個Alexa Fluor 546，一個Cy5和四個Si-rhodamine分子（圖4C–4E）。作者觀察到，不同熒光染料在“on”或
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