分享一篇近期發(fā)表在J. Am. Chem. Soc.上的研究進(jìn)展，題為： Selective pH-Responsive Conjugation between a Pair of De Novo Discovered Peptides。該工作的通訊作者是來自東京大學(xué)的Yuto Ohno。
在生物化學(xué)領(lǐng)域，實現(xiàn)肽和蛋白質(zhì)的選擇性修飾是一項至關(guān)重要的技術(shù)。傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)修飾方法雖然能夠制備出均一的蛋白質(zhì)-小分子偶聯(lián)物，但這些方法通常是不可逆的。相比之下，現(xiàn)有的可逆蛋白質(zhì)標(biāo)記技術(shù)往往不具備位點(diǎn)選擇性。本文作者開發(fā)了一種全新的策略，發(fā)現(xiàn)了一對能夠選擇性反應(yīng)的肽，它們在中性條件下（pH 7.5）形成穩(wěn)定的偶聯(lián)物，但在堿性條件下（pH 10.0）迅速解離（圖1）。圖1. 本文研究示意圖，ITC6與CP1的選擇性反應(yīng) 異硫氰酸酯通常用作蛋白質(zhì)標(biāo)記試劑：異硫氰酸熒光素（FITC）可能是最常用的熒光團(tuán)之一，它主要與蛋白質(zhì)賴氨酸殘基反應(yīng)形成穩(wěn)定的硫脲鍵。該反應(yīng)通常不具有選擇性并且需要較高的pH值加速。異硫氰酸酯和硫醇反應(yīng)更快，但是反應(yīng)可逆，通常不會形成穩(wěn)定的偶聯(lián)物（圖2）?；诖?，作者假設(shè)含半胱氨酸的肽與含異硫氰酸酯的探針之間的可逆反應(yīng)可以作為相互選擇性、刺激響應(yīng)性化學(xué)的基礎(chǔ)。 為了發(fā)現(xiàn)能夠形成穩(wěn)定偶聯(lián)物的肽序列，作者使用了mRNA顯示的一種變體RaPID（隨機(jī)非標(biāo)準(zhǔn)多肽整合發(fā)現(xiàn)），這是一個能夠生成和篩選大的（>1012序列）遺傳編碼肽文庫的發(fā)現(xiàn)平臺，通常用于識別所選蛋白質(zhì)的高親和力肽配體。 作者設(shè)計了一個兩階段的發(fā)現(xiàn)過程。作者首先通過與小分子異硫氰酸酯的反應(yīng)篩選含有Cys的多肽分子，再通過與第一步篩選得到的含Cys多肽分子的反應(yīng)，篩選含有異硫氰酸酯的多肽分子。 作者設(shè)計了一個編碼含半胱氨酸環(huán)肽的mRNA庫，并通過與含生物素的異硫氰酸酯ITC1的反應(yīng)進(jìn)行篩選（圖3）。經(jīng)過六輪篩選，通過測序分析確定了幾個富含半胱氨酸的序列家族。進(jìn)一步合成和表征后，發(fā)現(xiàn)CP1與ITC1形成的偶聯(lián)物最為穩(wěn)定，因此被選為后續(xù)研究的對象。 接下來，作者設(shè)計了一個編碼含異硫氰酸酯環(huán)肽的mRNA庫，并與生物素化的CP1進(jìn)行反應(yīng)篩選（圖4）。經(jīng)過七輪篩選，通過測序分析，確定了幾個富含異硫氰酸酯的序列。進(jìn)一步合成和表征后，發(fā)現(xiàn)ITC6與CP1形成的偶聯(lián)物具有最高的動力學(xué)穩(wěn)定性，因此被選為后續(xù)研究的對象。 接著作者詳細(xì)表征了ITC6與CP1的反應(yīng)（圖5）。作者通過與CP8和ITC8的交叉反應(yīng)驗證，證明了CP1與ITC6反應(yīng)更加迅速，形成的偶聯(lián)物DTC1.6在中性條件下更穩(wěn)定。作者后續(xù)通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC/MS）和核磁共振（NMR）光譜分析，確證了DTC1.6的結(jié)構(gòu)。圖6. DTC1.6產(chǎn)物穩(wěn)定性探究 隨后作者研究了DTC1.6中二硫代氨基甲酸酯鍵穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的決定因素（圖6）。作者首先將兩者的序列打亂以及環(huán)打開，發(fā)現(xiàn)序列和環(huán)狀結(jié)構(gòu)的影響對于CP1更大。作者后續(xù)改變了異硫氰酸酯的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)CP1與小分子異硫氰酸酯的反應(yīng)性較差。作者通過丙氨酸掃描突變研究，發(fā)現(xiàn)CP1中的6RDCXXXXP14W基序和CP1與ITC6之間的靜電相互作用對偶聯(lián)物的穩(wěn)定性至關(guān)重要。此外，鹽濃度也顯著影響偶聯(lián)物的穩(wěn)定性，相比于DTC1.1，通過靜電穩(wěn)定的DTC1.6隨著氯化鈉濃度增加，半衰期迅速下降。圖7. DTC1.6的pH響應(yīng)性解離及應(yīng)用 最后作者展示了DTC1.6的pH響應(yīng)性解離及其在生物化學(xué)中的應(yīng)用（圖7）。研究發(fā)現(xiàn)，DTC1.6在pH為7.5時半衰期為347 min，而在pH為10時，半衰期降低至5 min。這一特性使得ITC6可以作為拉下試劑從含巰基的復(fù)雜生物樣品中選擇性分離CP1，同時也可作為臨時保護(hù)基團(tuán)保護(hù)CP1免受非特異性半胱氨酸標(biāo)記試劑的影響。 綜上，本文開發(fā)了一對能夠選擇性反應(yīng)的環(huán)肽，它們具有中性pH下相互的專一偶聯(lián)選擇性以及高pH下解離能力。這一化學(xué)體系有望在更多領(lǐng)域展現(xiàn)出其獨(dú)特的優(yōu)勢和廣泛的應(yīng)用前景。DOI: 10.1021/jacs.4c08520Link: https://doi.org/10.1021/jacs.4c08520
