一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介
鄰近標(biāo)記技術(shù)已被成功應(yīng)用于鑒定蛋白靶標(biāo),相比傳統(tǒng)的Pulldown/IP+MS技術(shù),鄰近標(biāo)記技術(shù)可以解決鑒定弱或瞬時(shí)相互作用、研究膜蛋白等諸多問(wèn)題。根據(jù)結(jié)核分枝桿菌類泛素蛋白酶體系統(tǒng)中底物Pup分子在體外能夠招募PafA連接酶發(fā)揮鄰近標(biāo)記作用的實(shí)驗(yàn)原理，來(lái)自上海交通大學(xué)的科研團(tuán)隊(duì)研發(fā)了一項(xiàng)基于底物的新型鄰近標(biāo)記技術(shù)(專利號(hào)ZL202110069353.7),命名為Specific Pupyla-tion as lDEntity Reporter(SPIDER)。該技術(shù)可應(yīng)用于蛋白-蛋白、核酸-蛋白、小分子-蛋白等相互作用的驗(yàn)證和發(fā)現(xiàn)。
本試劑盒基于SPIDER鄰近標(biāo)記技術(shù),僅需準(zhǔn)備生物素化標(biāo)記的誘餌分子(誘餌RNA)，加入待反應(yīng)樣本(純化蛋白、細(xì)胞/組織裂解液)及SPIDER反應(yīng)體系啟動(dòng)反應(yīng),誘餌分子(Bait)和目標(biāo)蛋白(Prey)之間的非共價(jià)結(jié)合被轉(zhuǎn)化為目標(biāo)蛋白和鏈霉親和素之間的共價(jià)連接,隨后目標(biāo)蛋白可以被生物素瓊脂糖親和富集并進(jìn)行質(zhì)譜鑒定
相比其他互作檢測(cè)產(chǎn)品,該方法無(wú)需提前將標(biāo)簽和誘餌分子進(jìn)行融合,擺脫對(duì)融合蛋白表達(dá)準(zhǔn)確性的依賴,操作相對(duì)簡(jiǎn)單,應(yīng)用范圍廣。此外,該產(chǎn)品后續(xù)使用嚴(yán)苛的條件進(jìn)行清洗,可顯著降低非特異蛋白的干擾,富集能力強(qiáng),結(jié)果準(zhǔn)確性更高,同時(shí)兼具操作簡(jiǎn)單快捷的優(yōu)點(diǎn)。
二、產(chǎn)品應(yīng)用范圍
用于RNA的結(jié)合蛋白/靶標(biāo)蛋白的篩選和發(fā)現(xiàn)
僅適用于體外反應(yīng)
僅用于科學(xué)研究
四、需要您自行準(zhǔn)備的主要試劑、耗材和儀器
1.生物素標(biāo)記的RNA
1)誘餌RNA: 生物素標(biāo)記RNA,2rxns共需1.2nmol,建議最小濃度為10 μM。建議誘餌RNA的長(zhǎng)度在 50 nt以內(nèi)，生物素與RNA之間的Linker需要足夠長(zhǎng),至少2~3個(gè)PEG,防止生物素影響RNA與互作蛋白的結(jié)合。
2)對(duì)照RNA(可選):如果誘餌RNA為修飾RNA(如m'A),需要提供生物素標(biāo)記非修飾RNA作為對(duì)照RNA,2rxns共需1.2nmol,建議最小濃度為10μM。建議對(duì)照RNA的長(zhǎng)度在50 nt以內(nèi)生物素與RNA之間的Linker需要足夠長(zhǎng),至少2~3個(gè)PEG,防止生物素影響RNA與互作蛋白的結(jié)合。
2.細(xì)胞/組織裂解液
4 rxns共需細(xì)胞/組織裂解液中總蛋白含量為12 mg,最小濃度不低于1 mg/mL。
特別提示:
細(xì)胞裂解時(shí)，Cell Lysate Buffer的有效成分建議使用非離子型去污劑，如1%NP-40其作用溫和，保留蛋白的天然構(gòu)象以及相互作用:酶抑制劑應(yīng)避免使用AEBSF或帶有AEBSF組分的Cocktai，AEBSF會(huì)抑制SPIDER反應(yīng)。
3.其它需要的主要試劑
RNase 抑制劑:終濃度為10 U/mL,4rxns反應(yīng)液共24 mL。
Tween 20:共需40 μL,可完成4 rxns。
4.耗材
需要使用無(wú)RNA酶的15 mL離心管,1.5 mL EP管,一次性吸頭。
5.儀器
滿足500xg微量離心機(jī)，以及15 mL離心管,500xg的水平離心機(jī);渦旋振蕩器，旋轉(zhuǎn)混勻器(水平混勻器、三維混勻器可作為備選)。37℃℃水浴鍋，4℃℃冰箱。
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