一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介
鄰近標(biāo)記技術(shù)已被成功應(yīng)用于鑒定蛋白靶標(biāo),相比傳統(tǒng)的Pulldown/IP+MS技術(shù),鄰近標(biāo)記技術(shù)可以解決鑒定弱或瞬時(shí)相互作用、研究膜蛋白等諸多問題。根據(jù)結(jié)核分枝桿菌類泛素蛋白酶體系統(tǒng)中底物Pup分子在體外能夠招募PafA連接酶發(fā)揮鄰近標(biāo)記作用的實(shí)驗(yàn)原理,來自上海交通大學(xué)的科研團(tuán)隊(duì)研發(fā)了一項(xiàng)基于底物的新型鄰近標(biāo)記技術(shù)(專利號(hào)ZL202110069353.7),命名為Specific Pupyla-tion as IDEntity Reporter (SPIDER)。該技術(shù)可應(yīng)用于蛋白-蛋白、核酸-蛋白、小分子-蛋白等相互作用的驗(yàn)證和發(fā)現(xiàn)。
本試劑盒基于SPIDER鄰近標(biāo)記技術(shù),僅需準(zhǔn)備生物素化標(biāo)記的誘餌分子,加入待反應(yīng)樣本(細(xì)胞)及SPIDER反應(yīng)體系啟動(dòng)反應(yīng),誘餌分子(Bait)和目標(biāo)蛋白(Prey)之間的非共價(jià)結(jié)合被轉(zhuǎn)化為目標(biāo)蛋白和鏈霉親和素之間的共價(jià)連接，隨后裂解細(xì)胞,目標(biāo)蛋白可以被生物素瓊脂糖親和富集并進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。
相比其他互作檢測(cè)產(chǎn)品,該方法無需提前將標(biāo)簽和誘餌分子進(jìn)行融合,擺脫對(duì)融合蛋白表達(dá)準(zhǔn)確性的依賴,操作相對(duì)簡(jiǎn)單,應(yīng)用范圍廣。 此外,該產(chǎn)品后續(xù)使用嚴(yán)苛的條件進(jìn)行清洗,可顯著降低非特異蛋白的干擾，富集能力強(qiáng),結(jié)果準(zhǔn)確性更高,同時(shí)兼具操作簡(jiǎn)單快捷的優(yōu)點(diǎn)。
二、產(chǎn)品應(yīng)用范圍
用于完整細(xì)胞檢測(cè)，適用于活細(xì)胞表面結(jié)合蛋白/靶標(biāo)蛋白的篩選與發(fā)現(xiàn)
僅適用于體外反應(yīng)
僅用于科學(xué)研究
四、需要您自行準(zhǔn)備的主要試劑、耗材和儀器
1.生物素標(biāo)記的小分子/重組蛋白
1)生物素標(biāo)記的重組蛋白/小分子(Biotin-Bait):4 rxns共需4 nmol,建議最小濃度為10 μM,例如蛋白大小為50 kDa,最小摩爾濃度為10 μM,最小質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL;生物素標(biāo)記位點(diǎn)盡量在最低程度上影響蛋白活性/小分子。
特別提示:
生物素與重組蛋白/小分子之間需要柔性Linker,建議2~3個(gè)PEG,防止重組蛋白影響生物素與鏈霉親和素的結(jié)合,或者生物素影響重組蛋白/小分子表面構(gòu)象與活性。
2)非標(biāo)記小分子(重組蛋白無需準(zhǔn)備):2rxns共需200nmol,建議最小濃度為1 mM。
2.細(xì)胞樣本
1)貼壁細(xì)胞:準(zhǔn)備4份待測(cè)細(xì)胞樣本,將細(xì)胞培養(yǎng)于15 cm平皿中,長(zhǎng)至90%以上,約2*107個(gè)細(xì)胞。
2)懸浮細(xì)胞: 4 rxns 共需8*107個(gè)細(xì)胞。
3.其它需要的主要試劑
Cell Lysate Buffer: 貼壁細(xì)胞進(jìn)行反應(yīng)4 rxns共需12 mL,懸浮細(xì)胞進(jìn)行反應(yīng)4 rxns共需4 mL。
酶抑制劑:如PMSF,添加至Cel Lysate Buffer中,終濃度為0.5 mM,防止蛋白降解。
特別提示:
建議使用RIPA(強(qiáng))等作為細(xì)胞裂解液,有效成分為離子型去污劑如SDS,并在使用時(shí)加入終濃度為0.5 mM的酶抑制劑如PMSF,即加即用。酶抑制劑應(yīng)避免使用AEBSF或帶有AEBSF組分的Cocktai，AEBSF會(huì)抑制SPIDER反應(yīng)。
4.耗材
15 mL離心管,1.5 mL EP管,一次性吸頭。
5.儀器
可用于500xg的微量離心機(jī)，以及15 mL離心管，500xg的水平離心機(jī);渦旋振蕩器，旋轉(zhuǎn)混勻器(水平混勻器、三維混勻器可作為備選);37℃水浴鍋，4℃℃冰箱。
如有需要可聯(lián)系我們：
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