一、產(chǎn)品簡介
鄰近標(biāo)記技術(shù)已被成功應(yīng)用于鑒定蛋白靶標(biāo),相比傳統(tǒng)的Pulldown/IP+MS技術(shù),鄰近標(biāo)記技術(shù)可以解決鑒定弱或瞬時相互作用、研究膜蛋白等諸多問題。根據(jù)結(jié)核分枝桿菌類泛素蛋白酶體系統(tǒng)中底物Pup分子在體外能夠招募PafA連接酶發(fā)揮鄰近標(biāo)記作用的實驗原理，來自上海交通大學(xué)的科研團(tuán)隊研發(fā)了一項基于底物的新型鄰近標(biāo)記技術(shù)(專利號ZL202110069353.7),命名為Specific Pupyla-tion as IDEntity Reporter(SPIDER)。該技術(shù)可應(yīng)用于蛋白-蛋白、核酸-蛋白、小分子-蛋白等相互作用的驗證和發(fā)現(xiàn)。
本試劑盒基于SPIDER鄰近標(biāo)記技術(shù),僅需準(zhǔn)備生物素化標(biāo)記的誘餌分子,加入待反應(yīng)樣本(純化蛋白、細(xì)胞/組織裂解液)及SPIDER反應(yīng)體系啟動反應(yīng),誘餌分子(Bait)和目標(biāo)蛋白(Prey)之間的非共價結(jié)合被轉(zhuǎn)化為目標(biāo)蛋白和鏈霉親和素之間的共價連接，隨后目標(biāo)蛋白可以被生物素瓊脂糖親和富集并進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。相比其他互作檢測產(chǎn)品,該方法無需提前將標(biāo)簽和誘餌分子進(jìn)行融合,擺脫對融合蛋白表達(dá)準(zhǔn)確性的依賴，操作相對簡單，應(yīng)用范圍廣。此外,該產(chǎn)品后續(xù)使用嚴(yán)苛的條件進(jìn)行清洗,可顯著降低非特異蛋白的干擾,富集能力強(qiáng),結(jié)果準(zhǔn)確性更高,同時兼具操作簡單快捷的優(yōu)點。
二、產(chǎn)品應(yīng)用范圍
用于小分子、重組蛋白的結(jié)合蛋白/靶標(biāo)蛋白的篩選和發(fā)現(xiàn)
僅適用于體外反應(yīng)
僅用于科學(xué)研究
四、需要您自行準(zhǔn)備的主要試劑、耗材和儀器
1.生物素標(biāo)記的小分子/重組蛋白
1)生物素標(biāo)記的小分子/重組蛋白:4rxns共需2.4nmol,建議最小濃度為10 μM; 生物素標(biāo)記位點盡量在最低程度上影響小分子/蛋白活性。
特別提示:
生物素與小分子/重組蛋白之間需要柔性Linker,建議2~3個PEG,防止重組蛋白影響生物素與鏈霉親和素的結(jié)合,或者生物素影響重組蛋白/小分子表面構(gòu)象與活性。
2)非標(biāo)記小分子(重組蛋白無需準(zhǔn)備):2rxns共需120 nmo,建議最小濃度為1mM。
2.細(xì)胞/組織裂解液
4 rxns共需細(xì)胞/組織裂解液中總蛋白12 mg,建議最小濃度為1 mg/mL。
特別提示:
細(xì)胞裂解時,Cell Lysate Buffer的有效成分建議使用非離子型去污劑,如1%NP-40,其作用溫和，能夠保留蛋白的天然構(gòu)象以及相互作用;酶抑制劑應(yīng)避免使用AEBSF或帶有AEBSF組分的Cocktai，AEBSF會抑制SPIDER反應(yīng)。
3.其它需要的主要試劑
Tween 20:共需40 μL,可完成4 rxns。
4.耗材
15 mL離心管,1.5 mL EP管,一次性吸頭。
5.儀器
可用于500xg的微量離心機(jī)，以及15mL離心管，500xg的水平離心機(jī);渦旋振蕩器，旋轉(zhuǎn)混勻器(水平混勻器、三維混勻器可作為備選);37℃水浴鍋，4℃冰箱。
如有需要可聯(lián)系我們：
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