鹵化反應被用來輔助構(gòu)建復雜分子并廣泛應用于合成工業(yè)，已成為不可或缺的合成工具。在生物合成及生物催化領(lǐng)域，鹵化酶也一直備受關(guān)注；但目前大多聚焦于黃素依賴的色氨酸鹵化酶的表征、機制及簡單底物的生物催化研究，作用于復雜底物的多鹵化酶反應機制及區(qū)域選擇性機制尚未得到解析。
在本項研究中，中國科學院上海有機化學研究所的唐功利研究員與北京大學的馬明教授、南京大學的梁勇教授、華東理工大學的華強教授合作，表征了一個復雜多芳環(huán)聚酮天然產(chǎn)物Naphthacemycin生物合成途徑中的黃素依賴鹵化酶（FDH）NatC及其同源蛋白FasV，可催化Naphthacemycin B1于不同位點發(fā)生五次鹵化后得到最終產(chǎn)物Naphthacemycin B13。通過酶動力學、時間-過程檢測以及計算模擬，作者確定了FasV催化底物發(fā)生的是有序多鹵化，這也說明FasV存在位點選擇性從而促使鹵化反應的有序發(fā)生。
通過解析FasV的蛋白晶體結(jié)構(gòu)并分析其與化合物1的對接結(jié)果，作者大致鎖定了與底物結(jié)合及反應相關(guān)的關(guān)鍵氨基酸殘基（包括形成?-?相互作用的W91，F(xiàn)93和F95等、形成氫鍵相互作用以及形成蛋白活性口袋疏水環(huán)境的T53，L81和I212等）。通過蛋白定點突變，作者獲得FasV的突變酶T53A，L81Y，F(xiàn)93W以及I212T均在一定程度上改善了FasV的區(qū)域選擇性，尤其是I212T，在基本沒有影響轉(zhuǎn)化率的情況下，實現(xiàn)了對單一位點的選擇。 隨后結(jié)合序列分析，密度泛函理論計算和分子動力學計算，作者發(fā)現(xiàn)FasV采用一種獨特的雙活化機制。在FasV類多鹵化蛋白當中，E49的羧基側(cè)鏈接近S50的羥基側(cè)鏈隨后發(fā)生質(zhì)子轉(zhuǎn)移促使S50活化底物，從而降低反應所需活化能；底物被活化后，此前經(jīng)K76活化的Cl+親電進攻芳香底物，在此過程中，S50拔去底物鹵化位置的氫原子以促進完成鹵素的取代。這與以往所報道的PrnA類單鹵化酶明顯不同，且所依賴的關(guān)鍵氨基酸殘基也不同。FasV所依賴的S50在PrnA中對應的氨基酸殘基為丙氨酸，而PrnA所依賴的E346在FasV中所對應的則是亮氨酸，這也從另一個側(cè)面表明多鹵化酶采用一種與單氯化酶不同的催化機制。此外，F(xiàn)asV的晶體結(jié)構(gòu)顯示其具有較大的活性口袋且接近蛋白表面，意味著該蛋白可能具有寬泛的底物譜，具備發(fā)展為生物催化劑的潛力。為此作者嘗試以化合物12為底物進行反應，在FasV的作用下，以75%的轉(zhuǎn)化率生成其二氯化產(chǎn)物13。 至此，綜合功能表征、酶動力學測定，蛋白結(jié)構(gòu)表征以及蛋白突變，DFT計算和MD計算，作者全面闡述了FasV采用一種新穎的雙活化催化機制促進多鹵化反應的有序發(fā)生，同時獲得了改善反應區(qū)域選擇性的突變酶。本項研究拓展了人們對鹵化酶催化機制的理解，展示了FasV類多鹵化酶被開發(fā)為生物催化劑的潛力。 論文信息 Functional Characterization and Molecular Basis of a Multi-Site Halogenase in Naphthacemycin Biosynthesis Dr. Yu Hu, Shu-Ya Peng, Dr. Xueyang Ma, Dr. Hongwei Chen, Dr. Qiu-Yue Nie, Dr. Jun-Bin He, Qianqian Chen, Dr. Qiang Zhou, Prof. Xin-Hua Lu, Prof.?Dr. Qiang Hua, Prof.?Dr. Donghui Yang, Prof.?Dr. Yong Liang, Prof.?Dr. Ming Ma, Prof.?Dr. Gong-Li Tang Angewandte Chemie International Edition DOI: 10.1002/anie.202418843 
