日韩不卡在线观看视频不卡,国产亚洲人成A在线V网站,处破女八a片60钟粉嫩,日日噜噜夜夜狠狠va视频

鹵化反應(yīng)被用來輔助構(gòu)建復(fù)雜分子并廣泛應(yīng)用于合成工業(yè)，已成為不可或缺的合成工具。在生物合成及生物催化領(lǐng)域，鹵化酶也一直備受關(guān)注；但目前大多聚焦于黃素依賴的色氨酸鹵化酶的表征、機(jī)制及簡(jiǎn)單底物的生物催化研究，作用于復(fù)雜底物的多鹵化酶反應(yīng)機(jī)制及區(qū)域選擇性機(jī)制尚未得到解析。

在本項(xiàng)研究中，中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所的唐功利研究員與北京大學(xué)的馬明教授、南京大學(xué)的梁勇教授、華東理工大學(xué)的華強(qiáng)教授合作，表征了一個(gè)復(fù)雜多芳環(huán)聚酮天然產(chǎn)物Naphthacemycin生物合成途徑中的黃素依賴鹵化酶（FDH）NatC及其同源蛋白FasV，可催化Naphthacemycin B1于不同位點(diǎn)發(fā)生五次鹵化后得到最終產(chǎn)物Naphthacemycin B13。通過酶動(dòng)力學(xué)、時(shí)間-過程檢測(cè)以及計(jì)算模擬，作者確定了FasV催化底物發(fā)生的是有序多鹵化，這也說明FasV存在位點(diǎn)選擇性從而促使鹵化反應(yīng)的有序發(fā)生。

通過解析FasV的蛋白晶體結(jié)構(gòu)并分析其與化合物1的對(duì)接結(jié)果，作者大致鎖定了與底物結(jié)合及反應(yīng)相關(guān)的關(guān)鍵氨基酸殘基（包括形成?-?相互作用的W91，F(xiàn)93和F95等、形成氫鍵相互作用以及形成蛋白活性口袋疏水環(huán)境的T53，L81和I212等）。通過蛋白定點(diǎn)突變，作者獲得FasV的突變酶T53A，L81Y，F(xiàn)93W以及I212T均在一定程度上改善了FasV的區(qū)域選擇性，尤其是I212T，在基本沒有影響轉(zhuǎn)化率的情況下，實(shí)現(xiàn)了對(duì)單一位點(diǎn)的選擇。

隨后結(jié)合序列分析，密度泛函理論計(jì)算和分子動(dòng)力學(xué)計(jì)算，作者發(fā)現(xiàn)FasV采用一種獨(dú)特的雙活化機(jī)制。在FasV類多鹵化蛋白當(dāng)中，E49的羧基側(cè)鏈接近S50的羥基側(cè)鏈隨后發(fā)生質(zhì)子轉(zhuǎn)移促使S50活化底物，從而降低反應(yīng)所需活化能；底物被活化后，此前經(jīng)K76活化的Cl⁺親電進(jìn)攻芳香底物，在此過程中，S50拔去底物鹵化位置的氫原子以促進(jìn)完成鹵素的取代。這與以往所報(bào)道的PrnA類單鹵化酶明顯不同，且所依賴的關(guān)鍵氨基酸殘基也不同。FasV所依賴的S50在PrnA中對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基為丙氨酸，而PrnA所依賴的E346在FasV中所對(duì)應(yīng)的則是亮氨酸，這也從另一個(gè)側(cè)面表明多鹵化酶采用一種與單氯化酶不同的催化機(jī)制。此外，F(xiàn)asV的晶體結(jié)構(gòu)顯示其具有較大的活性口袋且接近蛋白表面，意味著該蛋白可能具有寬泛的底物譜，具備發(fā)展為生物催化劑的潛力。為此作者嘗試以化合物12為底物進(jìn)行反應(yīng)，在FasV的作用下，以75%的轉(zhuǎn)化率生成其二氯化產(chǎn)物13。

至此，綜合功能表征、酶動(dòng)力學(xué)測(cè)定，蛋白結(jié)構(gòu)表征以及蛋白突變，DFT計(jì)算和MD計(jì)算，作者全面闡述了FasV采用一種新穎的雙活化催化機(jī)制促進(jìn)多鹵化反應(yīng)的有序發(fā)生，同時(shí)獲得了改善反應(yīng)區(qū)域選擇性的突變酶。本項(xiàng)研究拓展了人們對(duì)鹵化酶催化機(jī)制的理解，展示了FasV類多鹵化酶被開發(fā)為生物催化劑的潛力。