蛋白質(zhì)翻譯后修飾在細(xì)胞活動(dòng)中極為重要，參與了各種關(guān)鍵的生命過(guò)程，然而由于缺乏可靠、方便和低成本的傳感方法，只有少數(shù)翻譯后修飾在蛋白質(zhì)組層面被深入研究。納米孔傳感技術(shù)是一種強(qiáng)大的、無(wú)標(biāo)簽的單分子檢測(cè)手段，通過(guò)目標(biāo)分子穿過(guò)納米孔引發(fā)的離子電流變化來(lái)識(shí)別分子。近年來(lái)，納米孔傳感技術(shù)已成功應(yīng)用于檢測(cè)多肽鏈中的翻譯后修飾。但現(xiàn)有研究大多聚焦特定類(lèi)型的翻譯后修飾，并且對(duì)區(qū)分位置異構(gòu)體方面還存在很大局限性。 近日，中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所吳海臣研究員團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)出了一種基于主客體相互作用的納米孔傳感策略用于蛋白上翻譯后修飾的高效識(shí)別。該方法可以識(shí)別多肽探針特定位點(diǎn)的20種天然氨基酸和13種翻譯后修飾，通過(guò)將短肽納入探針來(lái)擴(kuò)展這一策略，從而能夠區(qū)分各種PTM、位置異構(gòu)體以及目標(biāo)多肽上的多個(gè)翻譯后修飾。 作者發(fā)現(xiàn)，利用苯丙氨酸（F）與葫蘆脲[7]（CB[7]）之間的主客體相互作用，可以顯著增強(qiáng)多肽探針與納米孔之間的相互作用，產(chǎn)生均一且穩(wěn)定的電流阻滯信號(hào)。基于此，作者構(gòu)建出了FGXD8探針，其中FG主要與CB7產(chǎn)生主客體相互作用，“X”為20種天然氨基酸或翻譯后修飾的氨基酸，D8為八個(gè)天冬氨酸，提供多肽穿過(guò)納米孔的電泳力。利用這種探針的高分辨率，結(jié)合野生型α溶血素納米孔（αHL）以及突變納米孔(M113F)7 αHL，作者實(shí)現(xiàn)了對(duì)于包括甲基化、乙?；⒘姿峄?、硫酸化和糖基化的13種翻譯后修飾以及20種天然氨基酸的完全區(qū)分。
作者進(jìn)一步嘗試將FGXD8中“X”的位置替換為短肽，構(gòu)成FG-pep-D8探針。以阿爾茨海默癥密切相關(guān)的tau蛋白為研究對(duì)象，選取tau蛋白突變體2N4R R1微管結(jié)合域的一段短肽（N’-SKIGSTEN-C’）作為模型肽，對(duì)短肽多個(gè)位點(diǎn)的磷酸化、甲基化和乙?；归_(kāi)研究。該體系對(duì)模型肽的多種翻譯后修飾、位置異構(gòu)體和多個(gè)翻譯后修飾都展現(xiàn)出良好的識(shí)別能力。通過(guò)機(jī)器學(xué)習(xí)輔助區(qū)分這些探針的信號(hào)，識(shí)別的準(zhǔn)確率高達(dá)0.941。 最終，作者將這一方法應(yīng)用于tau蛋白碎片的磷酸化修飾的檢測(cè)。他們選取了tau 2N4R結(jié)構(gòu)域的兩條胰蛋白酶/賴(lài)氨酸蛋白酶的水解產(chǎn)物肽，通過(guò)將這兩條酶切產(chǎn)物肽分別連接上FG和CD8構(gòu)成FG-pep-CD8探針，利用該探針穿過(guò)納米孔時(shí)產(chǎn)生的特征電流信號(hào)成功區(qū)分了這兩條多肽及其四種磷酸化異構(gòu)體。 隨著進(jìn)一步的改進(jìn)，該方法有望應(yīng)用于實(shí)際生物樣品中的翻譯后修飾檢測(cè)，為傳統(tǒng)質(zhì)譜方法提供有效的替代方案，并在生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。 論文信息 Nanopore-Based High-Resolution Detection of Multiple Post-Translational Modifications in Protein Ziyi Li, Yakun Yi, Yun Zhang, Yuanyuan Xiao, Qianyuan Ren, Ke Zhou, Lei Liu, Hai-Chen Wu Angewandte Chemie International Edition DOI: 10.1002/anie.202423801
