腸道菌群由于其復雜的組成和難于體外培養(yǎng)等特性，也被稱為腸道“暗物質”。腸道菌群具有復雜多樣的生理病理功能，但某一特定功能往往由特定的菌群亞群執(zhí)行，因此開發(fā)腸道細菌選擇性標記策略對于解析特定細菌的功能具有重要意義，同時也有助于理解微生物群落中存在的結構與分子多樣性。然而，現(xiàn)有的腸道細菌選擇性標記方法較為少見。 近日，復旦大學王煒研究員、麻錦彪教授和廈門大學楊朝勇教授團隊合作，基于細菌肽聚糖肽尾中L-氨基酸的多樣性，開發(fā)了一種熒光L-氨基酸（Fluorescent L-amino acid，F(xiàn)LAA）探針，該探針可通過代謝標記的方式在體選擇性標記小鼠腸道共生菌群中一個主要的革蘭氏陽性細菌科—毛螺菌科（Lachnospiraceae）。
首先，作者給小鼠灌胃FLAA后，發(fā)現(xiàn)其的確可以標記小鼠腸道中的部分細菌，且被標記的細菌具有相對一致的細胞形態(tài)。此外，通過熒光共定位成像及變?nèi)芫孛附饧毦毎趯嶒?，作者明確了探針的標記靶標是肽聚糖。 接下來，作者利用流式細胞分選結合16S rDNA測序發(fā)現(xiàn)探針標記的細菌多為毛螺菌科。而后，作者使用分別靶向Lachnospiraceae科以及該科中的幾個屬（Roseburia、Lachnospiraceae_NK4A136和Lachnoclostridium）的FISH探針對FLAA探針的特異性進行了驗證。此外，作者還對毛螺菌科下的幾株細菌進行了體外培養(yǎng)與標記，證明了FLAA的體外標記能力。 而后，作者以毛螺菌科的一株Roseburia faecis 菌為對象，對探針的標記機理進行了進一步表征。一方面，通過質譜分析確定了LAA的標記位點為肽聚糖肽尾的1號位氨基酸。另一方面，作者通過體外蛋白表達純化、酶促反應及動力學參數(shù)測定等分析手段，揭示了R. faecis中負責催化第1號位氨基酸偶聯(lián)的MurC連接酶（RfMurC）相比其他細菌的MurC具有明顯更高的氨基酸底物容忍性。 為深入理解RfMurC對非典型氨基酸底物的容忍性，作者通過X射線晶體衍射解析了其分子結構，發(fā)現(xiàn)RfMurC中氨基酸結合域的位置與其他細菌的MurC相比具有顯著差異，并且其三個結構域組成的底物結合空間明顯較其他細菌的更大，這在某種程度上解釋了RfMurC為何具有更高氨基酸底物容忍性。 最后，作者考慮到肽聚糖片段具有通過激活NOD1/2受體參與宿主固有免疫激活的作用，再結合實驗中發(fā)現(xiàn)的腸道共生菌肽聚糖第1號位存在非典型氨基酸的事實，作者進一步探究了包含非Ala的肽聚糖片段對NOD1/2受體的激活情況。發(fā)現(xiàn)相比于典型肽聚糖片段，第1號位含有非典型氨基酸的肽聚糖片段對NOD1/2受體的激活明顯下調(diào)甚至失活。 綜上，該工作基于熒光L-氨基酸探針開發(fā)了在體選擇性標記毛螺菌科細菌的代謝標記策略，明確解析了探針的標記位點并發(fā)現(xiàn)了毛螺菌科中獨特的MurC結構和肽聚糖組成。該策略的開發(fā)有望為深入研究毛螺菌科這一具有重要生理功能的菌群亞群提供幫助。 該工作共同第一作者為廈門大學博士研究生杜雅慧和復旦大學王翌霞博士，通訊作者是復旦大學王煒研究員、廈門大學楊朝勇教授和復旦大學麻錦彪教授。 論文信息 Unusual MurC Ligase and Peptidoglycan Discovered in Lachnospiraceae Using a Fluorescent L-Amino Acid Based Selective Labeling Probe Yahui Du, Yixia Wang, Ming Yang, Liyuan Lin, Jie Zhang, Zhi Huang, Chang Liu, Shuangjiang Liu, Jinbiao Ma, Chaoyong Yang, Wei Wang Angewandte Chemie International Edition DOI: 10.1002/anie.202503049
