推薦一篇發(fā)表在JACS上的文章“Triple Labeling Resolves a GPCR Intermediate State by Using Three-Color Single Molecule FRET”，通訊作者是來(lái)自法國(guó)蒙彼利埃大學(xué)的Robert B. Quast和來(lái)自德國(guó)慕尼黑路德維希-馬克西米利安大學(xué)的Don C. Lamb，其中Quast教授的研究方向是活細(xì)胞成像和結(jié)構(gòu)生物學(xué)，Lamb教授的研究方向是FRET和熒光顯微鏡。
研究動(dòng)態(tài)蛋白質(zhì)復(fù)合物中構(gòu)象變化具有較大的挑戰(zhàn)性，因?yàn)榇蠖鄶?shù)結(jié)構(gòu)方法依賴于大量分子狀態(tài)的平均信息。單分子FRET是監(jiān)測(cè)此類構(gòu)象變化的有力工具。本文中，作者提出了一種正交的三重標(biāo)記策略，該策略不受天然反應(yīng)性氨基酸功能的影響，通過在人代謝型谷氨酸受體 2（mGlu2，一種二聚體、多結(jié)構(gòu)域的神經(jīng)G蛋白偶聯(lián)受體）上建立3色傳感器，并使用3色單分子FRET描述以前未知的構(gòu)象中間狀態(tài)。
mGlu2受體對(duì)調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性和突觸傳遞至關(guān)重要，這種二聚體的冷凍電子顯微鏡結(jié)構(gòu)表明其可以從無(wú)活性的靜止開放（RO）狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛顒?dòng)的關(guān)閉激活狀態(tài)（AC）。這一結(jié)構(gòu)變化主要涉及配體（谷氨酸作為激動(dòng)劑）誘導(dǎo)VFT結(jié)構(gòu)域的閉合，兩個(gè)亞基相對(duì)于彼此的重新定位，使VFT結(jié)構(gòu)域的下葉更接近，以及相鄰7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的界面變化。然而近期研究發(fā)現(xiàn)兩種狀態(tài)之間存在動(dòng)態(tài)平衡，即靜息和活動(dòng)狀態(tài)之間存在中間狀態(tài)，研究VFT結(jié)構(gòu)域的閉合和重定向過程對(duì)于識(shí)別和表征這一中間態(tài)是十分必要的。
為了表征這種潛在的中間狀態(tài)，作者建立了一種基于兩種不同非天然氨基酸和一個(gè)SNAP 標(biāo)簽的正交、位點(diǎn)特異性三重標(biāo)記策略。第一個(gè)供體選擇了SNAP標(biāo)簽標(biāo)記，主要是由于它不會(huì)影響表達(dá)產(chǎn)量，并且代謝標(biāo)記反應(yīng)快速且選擇性強(qiáng)；在第二個(gè)位點(diǎn)，作者選用反式環(huán)辛烯賴氨酸（TCOK）與四嗪染料衍生物之間的SPIEDAC組合來(lái)連接；第三個(gè)位點(diǎn)選擇了摻入的PrF與吡啶甲基疊氮化物染料衍生物之間CuAAC反應(yīng)來(lái)連接。最終作者測(cè)試了三重標(biāo)記反應(yīng)選擇性良好且有較好的響應(yīng)信號(hào)，得到3色傳感器。
接下來(lái)，作者同時(shí)測(cè)量了所有染料對(duì)之間單二聚體的FRET并研究了單個(gè)原聚體內(nèi)的上下裂片（D1 →A2）以跟蹤VFT結(jié)構(gòu)域關(guān)閉；以及兩個(gè)原聚體之間的下裂片（A1/D2 → A2）以跟蹤它們的重新定向。這一結(jié)果促使作者發(fā)現(xiàn)了一種以前未表征的中間狀態(tài)：其中VFT結(jié)構(gòu)域僅略微閉合，下葉保持靜止時(shí)的分離構(gòu)象。
總的來(lái)說，本文基于正交的三重標(biāo)記策略建立了蛋白上的三色FRET傳感器，發(fā)現(xiàn)了 mGlu2受體以前未知的中間狀態(tài)。
本文作者：FTY
責(zé)任編輯：MB
DOI：10.1021/jacs.4c18364
原文鏈接：https://doi.org/10.1021/jacs.4c18364
