通過(guò)對(duì)多種有機(jī)輔因子或金屬輔因子依賴(lài)的酶進(jìn)行功能的重新開(kāi)發(fā)，對(duì)映選擇性自由基生物催化領(lǐng)域取得了令人振奮的發(fā)展。在該領(lǐng)域早期的發(fā)展過(guò)程中，一個(gè)核心設(shè)計(jì)理念是：關(guān)鍵自由基中間體必須在酶的活性中心附近生成，通常需要依賴(lài)具有氧化還原活性的輔因子和/或底物-輔因子之間的電荷轉(zhuǎn)移復(fù)合物。在此類(lèi)機(jī)制中，自由基的啟動(dòng)步驟通常以底物與酶的結(jié)合與活化為前提。盡管這一策略已被廣泛驗(yàn)證，推動(dòng)了一系列高效的自由基生物催化反應(yīng)的誕生，但它也對(duì)那些本身不具備氧化還原活性輔因子或者輔因子氧化還原活性較低的酶形成了限制。
近日，美國(guó)加州大學(xué)圣塔芭芭拉分校（UCSB）楊揚(yáng)教授和匹茲堡大學(xué)（PITT）劉鵬教授合作在Angewandte Chemie International Edition上在線發(fā)表了題為“Cooperative Photometallobiocatalysis: Nonheme Fe Enzyme-Catalyzed Enantioconvergent Radical Decarboxylative Azidation, Thiocyanation and Isocyanation of Redox-Active Esters”的研究論文，實(shí)現(xiàn)了光/天然金屬酶協(xié)同催化的立體選擇自由基脫羧疊氮化、硫氰化與異氰化反應(yīng)，其中不對(duì)稱(chēng)自由基異氰化反應(yīng)屬于該類(lèi)反應(yīng)首次不對(duì)稱(chēng)報(bào)道（圖1）。
圖1. 光/天然金屬酶協(xié)同催化的自由基脫羧疊氮化、硫氰化與異氰化反應(yīng) 通過(guò)對(duì)一些列不同類(lèi)型非血紅素蛋白進(jìn)行篩選，間苯二酚裂解酶（metapyrocatechase, MPC）憑借28%的收率和77:23 e.r.的最優(yōu)初始活性脫穎而出。最終通過(guò)進(jìn)一步的條件優(yōu)化和定向進(jìn)化，研究人員得到了PpMPC I291L L155F F302Y （PpMPC疊氮化酶）， 可以以74%的收率，99.5:0.5 e.r.得到疊氮化產(chǎn)物；最終獲得三突變體 PpMPC I291L L155F I204L（PpMPC硫氰化酶），可以以54%，95:5 e.r.得到硫氰化產(chǎn)物。確定最優(yōu)反應(yīng)條件和突變體后，作者考察了該疊氮化和硫氰化反應(yīng)的底物普適性，研究表明，各種取代的芳環(huán)，雜芳環(huán)以及三級(jí)底物均具有較好的兼容性（圖2）。 圖2. 光/天然金屬酶協(xié)同催化的自由基疊氮化和硫氰化反應(yīng) 同時(shí)通過(guò)向反應(yīng)體系中加入苯胺作為氰酸酯捕獲試劑，通過(guò)該化學(xué)–酶串聯(lián)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了不對(duì)稱(chēng)異氰化，可以以20%的收率，98:2 e.r.獲得不對(duì)稱(chēng)脲產(chǎn)物8（圖3）。 圖3. 光/天然金屬酶協(xié)同催化的自由基異氰化反應(yīng) 為研究該非血紅素鐵酶催化的脫羧疊氮化反應(yīng)機(jī)制及其對(duì)映選擇性的來(lái)源，研究人員開(kāi)展了一系列計(jì)算研究。DFT研究表明，在酶活性中心中，疊氮發(fā)生自由基回彈時(shí)，以中間或末端氮原子為反應(yīng)位點(diǎn)均為動(dòng)力學(xué)上極易發(fā)生且熱力學(xué)放熱的過(guò)程，具體取決于自由基的優(yōu)先結(jié)合方式。經(jīng)典分子動(dòng)力學(xué)（MD）模擬發(fā)現(xiàn)：自由基的苯基位于非血紅素鐵中心與 H199 殘基之間，而 H199 位于 E265 的反式方向。與此同時(shí)，順式于 E265 的結(jié)合口袋被 Y255 與 Y302 兩個(gè)殘基阻擋，這兩個(gè)殘基通過(guò)在定向進(jìn)化中引入的 F302Y 突變所產(chǎn)生的氫鍵網(wǎng)絡(luò)連接。當(dāng)自由基的 (Re)-面暴露于疊氮離子方向時(shí)，芐基自由基上的最小取代基 H 朝向空間擁擠的 L155F 殘基方向，而 (Si)-面攻擊則由于芐基上的甲基與 L155F 殘基之間的立體排斥作用而受到不利影響（圖4）。 圖4. 機(jī)理研究 總結(jié)，UCSB楊揚(yáng)團(tuán)隊(duì)和匹茲堡大學(xué)的劉鵬團(tuán)隊(duì)通過(guò)工程化非血紅素鐵酶與精心篩選的光催化劑之間的協(xié)同作用，開(kāi)發(fā)了一套適用于氧化還原活性酯的光–金屬–酶協(xié)同催化脫羧自由基疊氮化、硫氰化與異氰化反應(yīng)體系，為生物合成手性有機(jī)疊氮，硫氰化化合物提供了有價(jià)值的工具，對(duì)天然非血紅素依賴(lài)的金屬酶功能的開(kāi)發(fā)具有廣泛的影響。 論文信息 Cooperative Photometallobiocatalysis: Nonheme Fe Enzyme-Catalyzed Enantioconvergent Radical Decarboxylative Azidation, Thiocyanation, and Isocyanation of Redox-Active Esters Liu-Peng Zhao, Ken Lin, Pei-Pei Xie, Huichong Liu, Hengye Xiang, Xin Liu, Yunlong Zhao, Peng Liu, Yang Yang Angewandte Chemie International Edition DOI: 10.1002/anie.202506361
