分享一篇近期發(fā)表在Advanced Healthcare Materials上的文章，Enhanced Bone Repair using Callus Organoids Derived from Urine-Derived Stem Cells with Silk Fibroin。這篇文章的通訊作者是重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院的宋金林和維克森林大學(xué)再生醫(yī)學(xué)研究所的張圓圓。
骨缺損由創(chuàng)傷、腫瘤切除等引發(fā)，雖然骨有修復(fù)能力，但大缺損修復(fù)受限?，F(xiàn)有自體、異體及人工骨移植存在供體并發(fā)癥、免疫反應(yīng)、骨整合差等局限。骨痂作為骨缺損處臨時(shí)組織，在自然愈合中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其類器官作為干細(xì)胞自組裝3D培養(yǎng)物，能模擬體內(nèi)細(xì)胞間及細(xì)胞-ECM互作等微環(huán)境，優(yōu)于2D培養(yǎng)。然而純干細(xì)胞類器官缺乏血管和ECM支持，故需結(jié)合人工ECM。絲素蛋白（SF）具良好生物相容性、機(jī)械性能及可調(diào)降解率，適合構(gòu)建ECM，其纖維基質(zhì)可維持尿源干細(xì)胞（USCs）活性。USCs從尿液無創(chuàng)獲取，無倫理問題，可分化為成骨細(xì)胞等，具有骨愈合潛力。
基于以上背景，作者評(píng)估了SF纖維段在增加USC基骨痂類器官的孔隙率、活性和促成熟能力。通過優(yōu)化纖維直徑和密度，為骨愈合提供新策略。
作者首先通過靜電紡絲法制備了8% - 12%不同濃度的絲素蛋白（SF）纖維段，經(jīng)PBS浸泡8周觀察其性能。結(jié)果顯示，12% SF 纖維直徑大、硬度高（8.1 GPa）、耐水性強(qiáng)，浸泡后結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，且無細(xì)胞毒性，其粗糙表面利于細(xì)胞黏附，為后續(xù)構(gòu)建 USC 基骨痂類器官提供了適宜的纖維基質(zhì)（圖1）。
圖1. SF 纖維段的表征
作者從尿液中提取USCs，通過形態(tài)學(xué)觀察和流式細(xì)胞術(shù)鑒定后，將其與不同密度的SF纖維段（0、50、100、500、1000 根/球）在3D模具中培養(yǎng)，構(gòu)建SF纖維-USC 球。結(jié)果顯示，USCs可在3天內(nèi)包裹纖維段形成球體，纖維添加不影響細(xì)胞聚集效率，其中SF1000-USC組因纖維過多致spheroid體積較小，而SFM組細(xì)胞分散，表明SF纖維段與USCs可成功構(gòu)建3D培養(yǎng)體系（圖2）。
圖2. USC的3D培養(yǎng)
作者優(yōu)化SF纖維段密度與直徑以提升類器官成熟時(shí)細(xì)胞活力。經(jīng)4周培養(yǎng)，SF500-USC組孔隙率穩(wěn)定、細(xì)胞活力最高，12%濃度纖維組細(xì)胞存活數(shù)最多。由此選定12% SF纖維、500根/球的密度構(gòu)建骨痂類器官，該組合可維持細(xì)胞活性并促進(jìn)類器官成熟（圖3）。
圖3. 纖維密度和靜電紡絲溶液濃度的優(yōu)化
作者通過流式細(xì)胞術(shù)、熒光染色及Western blot檢測細(xì)胞活力、凋亡及氧化應(yīng)激水平。結(jié)果顯示，SF-USC和SFM組凋亡細(xì)胞少于USC組，USC組脂質(zhì)過氧化、線粒體ROS水平更高，線粒體膜電位降低，SOD2蛋白表達(dá)顯著升高。表明SF纖維段可改善微環(huán)境，降低氧化應(yīng)激，提升細(xì)胞活力（圖4）。
圖4. 培養(yǎng)2周后愈傷組織類器官的活力、細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激
作者通過免疫染色、ALP活性檢測及茜素紅染色，評(píng)估SF纖維段對(duì)骨痂類器官成熟的促進(jìn)作用。結(jié)果顯示，SF-USC組在誘導(dǎo)1周時(shí)RUNX2表達(dá)上調(diào)，2周時(shí)OCN表達(dá)增加，ALP活性及礦化結(jié)節(jié)形成均優(yōu)于USC組，且SF-USC組細(xì)胞增殖潛力更高。表明SF纖維段可加速USCs成骨分化，促進(jìn)骨痂類器官成熟（圖5）。
圖5. 愈傷組織類器官的成熟評(píng)估
作者將培養(yǎng)2周的SF-USC類器官與GelMA混合，植入大鼠5mm顱骨缺損模型。8周后微-CT及組織學(xué)分析顯示，該組新骨體積、BV/TV比顯著高于對(duì)照組，H&E和Masson染色見新骨面積增加，免疫熒光示膠原1和OCN表達(dá)增強(qiáng)，且仍能檢測到植入的USCs，表明SF-USC類器官可有效促進(jìn)骨缺損修復(fù)（圖6）。
圖6. 手術(shù)后8周新骨形成的顯微CT分析
總的來講，本研究針對(duì)骨缺損修復(fù)中骨移植需求增加及現(xiàn)有策略的局限，提出使用USCs衍生的骨痂類器官結(jié)合SF的創(chuàng)新骨重建方法。通過靜電紡絲制備SF纖維段，優(yōu)化其密度和直徑后，與USCs共培養(yǎng)構(gòu)建多孔類器官，形成低氧化應(yīng)激微環(huán)境，促進(jìn)細(xì)胞活力與骨痂類器官成熟。該策略利用無創(chuàng)獲取的USCs和生物相容性良好的 SF，具備細(xì)胞節(jié)約、成本效益高的優(yōu)勢，為骨重建領(lǐng)域提供了重要進(jìn)展與臨床應(yīng)用潛力。
作者：JXD
DOI: 10.1002/adhm.202501852
Link: https://doi.org/10.1002/adhm.202501852
