分享一篇近期發(fā)表在JACS上的文章，題目為Self-Generative Singlet Oxygen (1O2)?Initiated Chemical Modification of Nuclear DNAs Combats Tumor Drug Resistance。文章的通訊作者是蘇州大學(xué)的史海斌教授。
多藥耐受性是腫瘤化療的主要問題，使用多種治療模式結(jié)合可以有效解決此問題。
圖1. 自生成單線態(tài)氧引發(fā)核DNA化學(xué)修飾示意圖
本文作者在此前的工作中證實，酶或光介導(dǎo)的內(nèi)源RNA共價修飾能夠作為非化療的模式有效殺傷腫瘤，而DNA作為細胞核中最重要的基因物質(zhì)，其共價化學(xué)修飾具有良好的耐藥腫瘤治療潛能。因此，本文作者將能夠在腫瘤微環(huán)境中產(chǎn)生大量單線態(tài)氧的四羧基苯基卟啉銅（Cu-TCPP）和連有呋喃以及阿霉素藥物（Dox）的正電荷穿膜肽（fTAT-Dox）共同封裝在葉酸-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯（FA-PEG-PCL）以及聚乙二醇-聚己內(nèi)酯（PEG-PCL）組裝成的膠束中，構(gòu)成腫瘤靶向的納米粒子FA(CT-fT-Dox)。該納米粒子能夠在葉酸的作用下被腫瘤細胞攝取并解散釋放出Cu-TCPP和fTAT-Dox，Cu-TCPP將腫瘤部位富集的過氧化氫轉(zhuǎn)化為單線態(tài)氧，而fTAT-Dox則能夠進入細胞核，在單線態(tài)氧的催化下其中的呋喃環(huán)通過環(huán)化反應(yīng)與DNA共價連接，延長Dox作用時間的同時阻礙DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，共同實現(xiàn)腫瘤的治療。
圖2. FA(CT-fT-Dox)體外自生成單線態(tài)氧
如圖2所示，作者制備了FA(CT-fT-Dox)膠束。紫外可見光譜中可同時觀察到Cu-TCPP和Dox的峰，證實了兩種組分皆被成功封裝。TEM和DLS證實了該膠束在水溶液中具有穩(wěn)定的單分散形貌。此外，對Dox在不同溶液中的釋放測試顯示，在pH為5.5的溶液中，Dox以較快速率釋放，而在pH為7.2的溶液中則釋放較慢，酸性條件下的釋放證實了該膠束在腫瘤微環(huán)境中的響應(yīng)性。Cu-TCPP能夠通過Russell機制將過氧化氫轉(zhuǎn)化為單線態(tài)氧，因而作者利用單線態(tài)氧傳感器檢測了該體系在過氧化氫存在下產(chǎn)生單線態(tài)氧的能力，熒光信號隨時間的增加證實了其良好的單線態(tài)氧產(chǎn)生效果。
圖3. 單線態(tài)氧引發(fā)核DNA化學(xué)修飾增強Dox的細胞保留
如圖3所示，作者表征了該膠束在細胞中的單線態(tài)氧產(chǎn)生能力。熒光成像顯示，僅有FA(CT-fT-Dox)和不含呋喃環(huán)的對照組FA(CT-T-Dox)具有單線態(tài)氧產(chǎn)生效果，不含Cu-TCPP的組都未觀察到熒光。接下來，由于單線態(tài)氧能夠抑制藥物外排泵P-糖蛋白（P-gp）的表達，作者通過WB檢測了P-gp的表達量，并證實了FA(CT-fT-Dox)組和FA(CT-T-Dox)組細胞中的P-gp表達量顯著降低，證實了Cu-TCPP能夠產(chǎn)生單線態(tài)氧破壞耐藥性。作者此前證實呋喃環(huán)能夠被單線態(tài)氧氧化后與堿基發(fā)生環(huán)化，因而作者檢測了此過程對藥物的細胞攝取與停留的影響。對細胞的熒光成像顯示FA(CT-fT-Dox)組具有最慢的熒光下降，證實了Dox的長時間滯留。此外，FA(CT-fT-Dox)和FA(CT-T-Dox)組中能觀察到Dox在核中的比例增加，這可能與單線態(tài)氧能夠促進fTAT-Dox溶酶體逃逸并進入細胞核有關(guān)。對細胞的3D成像也驗證了此結(jié)果，在72小時時，FA(CT-fT-Dox)具有最高的細胞核比例。作者將Dox更換為Cy5熒光染料，通過凝膠電泳中DNA條帶與Cy5信號位置重合證實了該體系能夠共價連接至DNA上。
圖4. 細胞毒性和DNA損傷效果
如圖4所示，作者通過細胞活死染色和流式細胞術(shù)證實了FA(CT-fT-Dox)具有最好的細胞殺傷效果。彗星實驗和γH2AX免疫熒光成像證實了FA(CT-fT-Dox)能產(chǎn)生最多的DNA損傷，凝膠電泳也顯示出DNA被碎片化。Bio-TEM成像中觀察到細胞形態(tài)的顯著破壞也證實了FA(CT-fT-Dox)的細胞殺傷效果。
圖5. 轉(zhuǎn)錄組測序分析和蛋白質(zhì)組學(xué)分析
如圖5所示，作者進行了轉(zhuǎn)錄組測序。FA(CT-fT-Dox)與PBS以及與FA(CT-T-Dox)之間有差異基因的數(shù)目遠大于PBS和FA(CT-T-Dox)，證實了FA(CT-fT-Dox)對細胞的基因表達有重大影響?；蜇S度顯示有關(guān)細胞周期、DNA復(fù)制以及DNA修復(fù)的基因表達顯著下調(diào)。熱圖分析也顯示許多細胞周期相關(guān)的生物標志物在FA(CT-fT-Dox)組中下調(diào)。此外，作者進行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析，FA(CT-fT-Dox)組的蛋白質(zhì)表達也具有很大差異，許多與細胞分裂、有絲分裂細胞周期、DNA復(fù)制與DNA修復(fù)相關(guān)的蛋白表達都顯著下調(diào)。
圖6. 自生成單線態(tài)氧引發(fā)核DNA化學(xué)修飾的體內(nèi)表征
由于FA(CT-fT-Dox)在680-800 nm處有較強的吸收，具有光聲效應(yīng)，有望作為光聲成像造影劑使用。因此如圖6所示，作者向荷瘤小鼠中靜脈注射FA(CT-fT-Dox)驗證其光聲成像應(yīng)用。光聲成像結(jié)果顯示，FA(CT-fT-Dox)組的小鼠腫瘤處能觀察到顯著的光聲信號，不含Cu-TCPP的對照組則無信號產(chǎn)生。接下來，作者證實了FA(CT-fT-Dox)在腫瘤微環(huán)境中將過氧化氫轉(zhuǎn)化為單線態(tài)氧的能力。瘤內(nèi)注射單線態(tài)氧傳感器分子，僅有FA(CT-fT-Dox)和FA(CT-T-Dox)有顯著熒光信號，證實這兩組中單線態(tài)氧的產(chǎn)生。對腫瘤中Dox含量的檢測也顯示FA(CT-fT-Dox)組具有最長的腫瘤滯留時間。
圖7. 體內(nèi)治療效果評估
如圖7所示，作者證實了FA(CT-fT-Dox)的腫瘤治療效果。對于腫瘤體積和質(zhì)量的檢測顯示出FA(CT-fT-Dox)具有最好的腫瘤抑制效果，組織病理學(xué)檢測和免疫熒光染色也都證實FA(CT-fT-Dox)具有最好的療效。
綜上所述，本文開發(fā)了一種由能產(chǎn)生單線態(tài)氧的Cu-TCPP和含呋喃環(huán)及化療藥物的穿膜肽所構(gòu)成的膠束，能夠在富過氧化氫的腫瘤微環(huán)境中通過Cu-TCPP的催化產(chǎn)生單線態(tài)氧，促使呋喃環(huán)和細胞核中的DNA共價連接，延長了藥物作用時間的同時破壞核DNA，從而有利于對耐藥腫瘤的治療。
作者：ZHR 審校：ZXY
DOI: 10.1021/jacs.5c02826
Link: https://doi.org/10.1021/jacs.5c02826
