選擇性氧官能化是構(gòu)建天然產(chǎn)物及藥物分子的關(guān)鍵反應(yīng)。酶催化的氧官能化以其高效、高選擇性和條件溫和等優(yōu)勢備受關(guān)注。作為該領(lǐng)域的“明星酶”，細(xì)胞色素P450酶（CYP450）雖被廣泛研究，但因自身穩(wěn)定性不足和依賴氧化還原伴侶等特性，使其在工業(yè)化生產(chǎn)中面臨諸多限制。同為血紅素依賴型金屬酶，非特異性過氧化物酶（UPOs）不僅催化特性媲美于CYP450，更兼具穩(wěn)定性高、催化活性強(qiáng)以及直接利用過氧化氫等優(yōu)勢，在工業(yè)應(yīng)用中展現(xiàn)出巨大潛力。然而作為真菌來源的分泌型酶，天然存在的UPOs種類有限以及其酶工程改造面臨的技術(shù)瓶頸，阻礙了該酶催化潛力的擴(kuò)展以及在工業(yè)生產(chǎn)中更廣泛的應(yīng)用。 β-酮酸酯的不對稱α-羥基化反應(yīng)是構(gòu)建重要手性α-羥基-β-二羰基結(jié)構(gòu)單元的一種高效合成策略。傳統(tǒng)化學(xué)催化方法通常面臨昂貴手性催化劑、有毒氧化劑和苛刻反應(yīng)條件等問題。針對這一挑戰(zhàn)，四川大學(xué)賈知軍團(tuán)隊通過對黑曲霉來源的非特異性過氧化物酶（AniUPO）進(jìn)行系統(tǒng)性酶工程改造，成功實現(xiàn)了一類生物催化領(lǐng)域尚未實現(xiàn)的β-酮酸酯的高效不對稱α-羥基化反應(yīng)，從而拓展了該類酶在氧官能團(tuán)化反應(yīng)中的應(yīng)用邊界，為其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。該酶催化體系兼容多種β-酮酸酯底物，能以優(yōu)異的產(chǎn)率（最高97%）和對映選擇性（最高>99:1 er）獲得各種α-羥基化產(chǎn)物。
作者首先篩選到一類來自Aspergillus niger的AniUPO，其對β-酮酸酯底物展現(xiàn)出最佳初始活性。隨后，通過對AniUPO進(jìn)行3輪酶工程改造獲得突變體AniUPO-M3，可將六元環(huán)底物的反應(yīng)活性提高52倍，er值達(dá)96:4。進(jìn)一步改造AniUPO-M3獲得了突變體AniUPO-M6，可將五元環(huán)底物的反應(yīng)活性提升5倍，er值達(dá)96:4。隨后，作者將優(yōu)勢突變體的基因整合至畢赤酵母基因組中，并成功實現(xiàn)了10 L發(fā)酵罐規(guī)模的酶高效表達(dá)。優(yōu)化反應(yīng)條件后，該非天然酶對五/六/七元環(huán)及線性β-酮酸酯底物均展現(xiàn)出良好兼容性，最高可達(dá)97%收率，4140 TTN，>99:1 er。制備級反應(yīng)和應(yīng)用研究展現(xiàn)出工程化AniUPO變體的巨大工業(yè)應(yīng)用潛力。 綜上，這項研究通過系統(tǒng)性挖掘和改造UPOs，成功開發(fā)了酶促β-酮酸酯的不對稱α-羥基化反應(yīng)。該生物催化體系展現(xiàn)出優(yōu)異的催化性能、廣泛的底物適用性以及良好的可規(guī)?；瘽摿?。本研究不僅創(chuàng)新性的解決了傳統(tǒng)化學(xué)轉(zhuǎn)化中面臨的苛刻條件依賴和昂貴氧化劑需求等關(guān)鍵難題，更拓展了UPOs在選擇性氧官能化反應(yīng)中的應(yīng)用邊界，為手性α-羥基β-酮酸酯的綠色合成開辟了全新的生物催化技術(shù)路徑。 論文信息 Engineering Unspecific Peroxygenases for Enantioselective α-Hydroxylation of β-Ketoesters Zhen-Yu Wang, Xin-Yuan Ma, Ying Wu, Yang Liu, Guang-Xin Lin, Xiao-Qi Liu, Prof. Dr. Chun Zhang, Dr. Peng Chen, Prof. Dr. Yongxiang Zheng, Prof. Dr. Zhi-Jun Jia Angewandte Chemie International Edition DOI: 10.1002/anie.202509359
