第一作者：黃麗文
通訊作者：姚鐘平/陳聲/黃麗文
通訊單位：香港理工大學(xué)/ 浙江大學(xué)
論文DOI：10.1021/jacs.5c05669
近期，香港理工大學(xué)姚鐘平團(tuán)隊(duì)聯(lián)合浙江大學(xué)黃麗文博士（原香港理工大學(xué)姚鐘平團(tuán)隊(duì)博士生）、香港理工大學(xué)陳聲團(tuán)隊(duì)、香港大學(xué)李學(xué)臣團(tuán)隊(duì)通過(guò)氫氘交換質(zhì)譜（HDX-MS）、分子動(dòng)力學(xué)模擬（MD）和功能實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)研究了NDM及其M154L突變體的構(gòu)象動(dòng)態(tài)與耐藥機(jī)制。研究揭示了該突變通過(guò)調(diào)控α3–L8–β9區(qū)域的構(gòu)象靈活性增強(qiáng)酶在鋅稀缺環(huán)境下的穩(wěn)定性，還首次提出該區(qū)域作為變構(gòu)調(diào)控中心的重要角色，為克服耐藥性問(wèn)題提供了新的靶點(diǎn)和設(shè)計(jì)思路。
新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶（NDM）的廣泛傳播性和強(qiáng)水解能力使其對(duì)碳青霉烯類等新一代抗生素表現(xiàn)出顯著耐藥性，成為全球抗感染治療的嚴(yán)重威脅。由于NDM活躍的基因水平轉(zhuǎn)移能力和快速進(jìn)化特性，其變異株在全球范圍內(nèi)擴(kuò)散，如臨床檢出率超過(guò)50% 的 M154L 突變體。該變體通過(guò)增強(qiáng)鋅離子親和力和熱穩(wěn)定性，在鋅離子匱乏環(huán)境下仍能維持耐藥性，且對(duì)現(xiàn)有鋅螯合類抑制劑（如曲霉明A，AMA）產(chǎn)生顯著耐受，而其分子機(jī)制尚未明確。
a）多維技術(shù)聯(lián)用：整合HDX-MS、分子動(dòng)力學(xué)模擬和功能實(shí)驗(yàn)，在溶液環(huán)境中捕捉NDM及其突變體的構(gòu)象動(dòng)態(tài)。
b）發(fā)現(xiàn)隱藏變構(gòu)區(qū)域：揭示α3–L8–β9區(qū)域作為構(gòu)象調(diào)控樞紐，響應(yīng)不同抑制劑并引導(dǎo)全局結(jié)構(gòu)變化。
c）突變體機(jī)制闡釋：闡明M154L突變通過(guò)提高區(qū)域柔性、優(yōu)化鋅離子結(jié)合，實(shí)現(xiàn)在低鋅環(huán)境下的功能維持。
d）提出靶向策略：指出該區(qū)域可作為新型抑制劑的理想靶點(diǎn)，推動(dòng)構(gòu)象導(dǎo)向的藥物設(shè)計(jì)。
研究發(fā)現(xiàn)，不同機(jī)制的抑制劑（L/D卡托普利、依布硒、AMA）與NDM結(jié)合時(shí)，均會(huì)誘導(dǎo)α3-L8-β8區(qū)域發(fā)生顯著的動(dòng)態(tài)擾動(dòng)，揭示該區(qū)域可能是此前未被識(shí)別的隱性變構(gòu)位點(diǎn)。
圖1. 不同抑制劑與NDM及其變異體結(jié)合模式的PCA圖
值得注意的是，M154L突變位點(diǎn)正落在此區(qū)域。該突變可使α3-L8及活性位點(diǎn)環(huán)（ASL）區(qū)域的氘代保護(hù)增強(qiáng)，從而有利于在鋅離子匱乏環(huán)境下維持酶的活性構(gòu)象。該研究還發(fā)現(xiàn)重塑α3-L8區(qū)域的構(gòu)象柔性并不顯著改變卡托普利結(jié)合引起的構(gòu)象變化，但對(duì)鋅離子相關(guān)抑制劑（如AMA和依布硒）呈現(xiàn)出截然相反的構(gòu)象差異。結(jié)合計(jì)算機(jī)模擬和功能實(shí)驗(yàn)，研究結(jié)果確證了M154L突變與改變NDM對(duì)鋅離子依賴具有直接關(guān)聯(lián)，并揭示了E152位點(diǎn)氫鍵網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵作用。
圖 | M154L突變誘導(dǎo)鋅離子耐受的構(gòu)象動(dòng)態(tài)機(jī)制示意圖
綜上所述，本研究綜合采用氫氘交換質(zhì)譜、分子動(dòng)力學(xué)模擬及功能實(shí)驗(yàn)，分析了三種不同抑制模式下金屬β-內(nèi)酰胺酶的動(dòng)態(tài)構(gòu)象，發(fā)現(xiàn)了其在進(jìn)化過(guò)程中與抗生素耐藥與鋅離子耐受相關(guān)的潛在位點(diǎn)。該突破挑戰(zhàn)了“突變僅優(yōu)化活性中心”的傳統(tǒng)認(rèn)知，揭示“構(gòu)象選擇”是耐藥性進(jìn)化的重要機(jī)制，也闡釋了該酶在進(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生耐藥性的調(diào)控機(jī)制，為克服細(xì)菌耐藥性提供了新的藥物設(shè)計(jì)思路。
黃麗文，男，浙江大學(xué)金華研究院項(xiàng)目經(jīng)理，金華質(zhì)科生物技術(shù)有限責(zé)任公司創(chuàng)始人。2015年畢業(yè)于浙江大學(xué)藥學(xué)院，2020年在香港理工大學(xué)獲得博士學(xué)位。2022年底全職加入浙江大學(xué)金華研究院轉(zhuǎn)化藥學(xué)創(chuàng)制中心，是浙江大學(xué)與浙江大學(xué)金華研究院聯(lián)合培養(yǎng)的博士后。獲國(guó)家博士后海外引才專項(xiàng)、浙江省海外引進(jìn)高層次青年人才、金華市“雙龍”領(lǐng)軍人才等項(xiàng)目資助。主持國(guó)家自然科學(xué)（青年）基金一項(xiàng)。2023年3月創(chuàng)辦金華質(zhì)科生物技術(shù)有限責(zé)任公司，專注于氫氘交換質(zhì)譜技術(shù)的研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化。研究方向包括蛋白質(zhì)氫氘交換質(zhì)譜及其在蛋白質(zhì)相互作用、藥物發(fā)現(xiàn)和質(zhì)量評(píng)價(jià)等方面的應(yīng)用。以第一作者身份在JACS、JBC、RCM等雜志發(fā)表研究論文。
