介紹一篇發(fā)表在Analytical Chemistry上的文章，Development of a Thiol?ene Microfluidic Chip for Hydrogen/Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS)，該研究的通訊作者是來(lái)自丹麥哥本哈根大學(xué)藥學(xué)系蛋白質(zhì)分析領(lǐng)域的Kasper D. Rand教授。
氫/氘交換質(zhì)譜技術(shù)是現(xiàn)代結(jié)構(gòu)生物學(xué)中一項(xiàng)不可或缺的強(qiáng)大工具，它通過(guò)精確測(cè)量蛋白質(zhì)主鏈酰胺氫與溶劑中氘原子發(fā)生交換的動(dòng)力學(xué)速率，能夠靈敏地揭示蛋白質(zhì)在溶液中的動(dòng)態(tài)構(gòu)象變化、折疊過(guò)程以及與其他生物分子的相互作用機(jī)理，是對(duì)X射線晶體學(xué)、冷凍電鏡等靜態(tài)結(jié)構(gòu)解析技術(shù)的有力補(bǔ)充。然而，盡管其應(yīng)用價(jià)值巨大，這項(xiàng)技術(shù)自誕生以來(lái)便長(zhǎng)期面臨著兩個(gè)難以逾越的瓶頸：首先是其運(yùn)行嚴(yán)重依賴昂貴且需要專業(yè)溫控系統(tǒng)的超高效液相色譜設(shè)備，這極大地提高了技術(shù)門檻和研究成本；其次是存在于分析過(guò)程中幾乎無(wú)法避免的“回交換”現(xiàn)象——即在氘標(biāo)記反應(yīng)被淬滅之后、質(zhì)譜檢測(cè)之前，那些已經(jīng)標(biāo)記在蛋白質(zhì)或肽段主鏈酰胺上的氘原子，會(huì)與流動(dòng)相中的普通氫原子發(fā)生逆向交換，導(dǎo)致寶貴的氘標(biāo)記信號(hào)在檢測(cè)前大量丟失。在目前通行的商業(yè)系統(tǒng)中，這種信號(hào)損失率通常高達(dá)30%至50%，這無(wú)疑嚴(yán)重侵蝕了數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性、動(dòng)態(tài)范圍和可靠性，限制了該技術(shù)在更復(fù)雜體系中的應(yīng)用。
為了從根本上突破這些技術(shù)瓶頸，Kasper D. Rand教授所領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊(duì)經(jīng)過(guò)精心設(shè)計(jì)與反復(fù)驗(yàn)證，成功開發(fā)出了一款名為HDXchip的創(chuàng)新型微流控芯片平臺(tái)。這款芯片的核心基材選用了具有優(yōu)異生物相容性和化學(xué)穩(wěn)定性的硫醇-烯聚合物，并采用了一種快速、廉價(jià)且適于規(guī)模化生產(chǎn)的兩步復(fù)制模塑工藝進(jìn)行制造。該芯片設(shè)計(jì)的精妙之處在于，它將一個(gè)完整氫/氘交換質(zhì)譜工作流程中所必需的所有關(guān)鍵操作單元——包括樣品引入與定量的樣品環(huán)、用于在線快速酶解的固定化胃蛋白酶整體柱微反應(yīng)器、以及基于反相色譜原理實(shí)現(xiàn)對(duì)肽段或蛋白質(zhì)進(jìn)行脫鹽、濃縮和梯度洗脫分離的色譜腔室——高度集成在了一個(gè)僅有數(shù)平方厘米的微型芯片之上。
圖1.HDXchip原理圖和設(shè)置。(A) HDXchip包含一個(gè)樣品環(huán)，(AA)取樣回路入口和ASM入口。(AB)樣品回路出口。(AC)原位形成用于胃蛋白酶固定的整體塊的芯片面積。(AD)甲醇ASM入口。(AE)BSM入口。(AF) RP固定相的芯片面積。(AG)與閥門相連的脫鹽出口。(AH)質(zhì)譜儀出口，(AI)虛線表示芯片與鋁熱電偶接觸的部分。(B) 3d打印芯片支架(黑色)、鋁熱電偶、Peltier模塊和液體散熱器效果圖。
然而，這款芯片的創(chuàng)新之處遠(yuǎn)不止于集成化。研究團(tuán)隊(duì)為其量身定制了一套高效且精準(zhǔn)的溫度控制系統(tǒng)，該系統(tǒng)利用多個(gè)堆疊的帕爾貼模塊作為制冷核心，配合高效的液體循環(huán)散熱裝置，能夠?qū)⑿酒线M(jìn)行色譜分離的關(guān)鍵區(qū)域持續(xù)且穩(wěn)定地冷卻至零下20攝氏度甚至更低的溫度。這種主動(dòng)式的深度冷卻能力，為抑制回交換提供了物理上的根本解決方案，而芯片自身微小的熱質(zhì)量使得這種快速降溫成為可能，這是傳統(tǒng)龐大而笨重的液相色譜系統(tǒng)所無(wú)法企及的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。
為了科學(xué)且嚴(yán)謹(jǐn)?shù)卦u(píng)估這款HDXchip芯片的實(shí)際性能，研究人員設(shè)計(jì)了一系列從簡(jiǎn)到繁的實(shí)驗(yàn)。他們首先選用了幾種結(jié)構(gòu)明確的小分子模型肽以及胰島素作為測(cè)試對(duì)象，專門用于量化芯片在抑制回交換方面的效能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)HDXchip在零下20攝氏度的深度冷卻環(huán)境下，并以優(yōu)化后的快速洗脫模式運(yùn)行時(shí)，幾種模型肽所測(cè)得的回交換率顯著低于文獻(xiàn)中普遍報(bào)道的數(shù)值，最低甚至出現(xiàn)了負(fù)值，這一現(xiàn)象暗示在某些特定條件下，氘標(biāo)記不僅沒(méi)有損失，可能還存在部分非酰胺氫的保留貢獻(xiàn)，但總體而言，其回交換控制水平遠(yuǎn)優(yōu)于傳統(tǒng)系統(tǒng)通常30%至50%的損失率。這初步證明了零下溫度對(duì)于減緩逆向交換速率的壓倒性優(yōu)勢(shì)。
圖2.最大氘標(biāo)記的模型肽和蛋白質(zhì)的反向交換。
在驗(yàn)證了基礎(chǔ)性能后，研究人員進(jìn)一步探索了HDXchip在更復(fù)雜分析場(chǎng)景中的應(yīng)用能力。他們首先進(jìn)行了“全局”氫/氘交換分析，即直接分析完整的蛋白質(zhì)分子。研究人員將胰島素、泛素和β-乳球蛋白三種蛋白質(zhì)的混合物進(jìn)行氘標(biāo)記后，直接在芯片上（不經(jīng)過(guò)在線酶解步驟）進(jìn)行脫鹽、分離和質(zhì)譜檢測(cè)。
圖3.胰島素、泛素和β-乳球蛋白的全球HDX-MS分析。
結(jié)果令人滿意，HDXchip成功地區(qū)分并高重復(fù)性地繪制出了這三種蛋白質(zhì)各自隨時(shí)間推移而逐漸攝入氘的動(dòng)力學(xué)曲線，其變化趨勢(shì)完全符合折疊蛋白質(zhì)預(yù)期的動(dòng)態(tài)行為，并且整體回交換率被控制在了一個(gè)較低的水平。這充分證明了該芯片在處理完整蛋白質(zhì)構(gòu)象分析方面的穩(wěn)健性與可靠性。
然而，真正的挑戰(zhàn)和芯片價(jià)值的極致體現(xiàn)在于其“局部”氫/氘交換分析能力，這要求芯片必須完美集成從酶解到分離的全流程。研究團(tuán)隊(duì)選擇了結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜的血紅蛋白作為模型，進(jìn)行了一次完整的時(shí)間分辨局部HDX-MS分析。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，氘標(biāo)記后的血紅蛋白樣品被注入芯片，隨后在流經(jīng)固定有胃蛋白酶的整體柱微反應(yīng)器時(shí)被快速酶解成肽段，這些肽段緊接著被輸送至填充有C18填料的反相色譜腔室進(jìn)行脫鹽和梯度洗脫分離，最后直接進(jìn)入質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)。整個(gè)流程在零下20攝氏度的低溫保護(hù)下流暢進(jìn)行。
圖3.HDXchip局部HDX-MS分析血紅蛋白。(A)Hbα中分析的肽的聯(lián)合提取離子色譜圖。(B)Hbα(24peptides整理的HDX-MS數(shù)據(jù)的覆蓋圖，覆蓋率97.2%，冗余度3.59)。二級(jí)螺旋結(jié)構(gòu)用方框標(biāo)記。(C)Hbβ(13多肽整理的HDX-MS數(shù)據(jù)的覆蓋率圖，覆蓋率為87.8%，冗余度為1.82)。二級(jí)螺旋結(jié)構(gòu)用方框標(biāo)記。(D)Hbα肽2?30的時(shí)間分辨HDX-MS數(shù)據(jù)。(E)Hbβ肽段33 - 42的時(shí)間分辨HDX-MS數(shù)據(jù)。
最終的分析結(jié)果非常出色：芯片不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)血紅蛋白α和β兩個(gè)亞基分別高達(dá)97.2%和87.8%的序列覆蓋率，能夠精準(zhǔn)定位氘原子在蛋白質(zhì)不同區(qū)域的攝入情況，更重要的是，對(duì)所有鑒定出的肽段進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)，其平均回交換率僅為25.4%。這一數(shù)值相較于使用傳統(tǒng)超高效液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行同類分析時(shí)常見(jiàn)的回交換水平，降低了超過(guò)二十個(gè)百分點(diǎn)，這是一個(gè)質(zhì)的飛躍，極大地提升了對(duì)蛋白質(zhì)局部構(gòu)象動(dòng)態(tài)變化的解析精度。
圖4.HDX數(shù)據(jù)到晶體結(jié)構(gòu)的映射。(A, B)標(biāo)記10 s后用歸一化HDX數(shù)據(jù)繪制的血紅蛋白(PDB: 4hbb)晶體結(jié)構(gòu)圖。晶體結(jié)構(gòu)的著色顯示了歸一化的攝取?；疑硎驹跁r(shí)間分辨HDX數(shù)據(jù)中未覆蓋的蛋白質(zhì)區(qū)域。位于α1β1-α2β2間期αG和βG螺旋的受保護(hù)肽的HDX譜顯示黑色(C, D)血紅素組;最大標(biāo)記的樣品顯示為十字形。(E, F)βA螺旋中未結(jié)構(gòu)鉸鏈區(qū)域Hbαin的肽71 - 81和Hbβsituated的肽2 - 15的HDX譜，標(biāo)記最多的樣品顯示為交叉。
綜上所述，這項(xiàng)由Rand教授團(tuán)隊(duì)所完成的研究工作，通過(guò)其設(shè)計(jì)的HDXchip微流控平臺(tái)，巧妙地利用了微流控技術(shù)的集成化、小型化優(yōu)勢(shì)，并結(jié)合了深度冷卻這一革命性的手段，成功地攻克了傳統(tǒng)氫/氘交換質(zhì)譜技術(shù)在設(shè)備成本和分析準(zhǔn)確性方面長(zhǎng)期存在的核心難題。這款芯片不僅通過(guò)高度集成簡(jiǎn)化了繁瑣的操作流程，降低了技術(shù)門檻和樣品消耗，更通過(guò)其卓越的溫控能力將回交換抑制到了一個(gè)前所未有的低水平，從而顯著提升了氫/氘交換實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的質(zhì)量和信息含量。這項(xiàng)研究為氫/氘交換質(zhì)譜技術(shù)乃至更廣泛的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析領(lǐng)域，指明了一條通向更高效率、更低成本、更優(yōu)性能的全新發(fā)展路徑，未來(lái)通過(guò)進(jìn)一步集成其他功能單元或與離子淌度等技術(shù)聯(lián)用，必將在生物制藥、疾病機(jī)理研究和基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)生物學(xué)中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。
這篇文章介紹了一種用新型硫烯材料制作的微流控芯片，專門用于氫氘交換質(zhì)譜分析。它就像給實(shí)驗(yàn)室裝上了“不粘鍋”和“自動(dòng)化流水線”，能極大地加快分析速度，并有效防止樣品損耗，讓蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究變得更高效、更精準(zhǔn)。
撰稿：令狐克鳳
編輯：李惠琳
參考文獻(xiàn)
1.Hansen AB, Svejdal RR, Aerts JT, Stahlhut VBP, Harmash D, Hamidi M, Sticker D, Kutter JP, Rand KD Development of a Thiol-ene Microfluidic Chip for Hydrogen/Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS). Anal Chem. 2025 Jun 24;97(24):12503-12512. doi: 10.1021/acs.analchem.4c06230. Epub 2025 Jun 9. PMID: 40488672; PMCID: PMC12199231.
