在金屬有機實驗室內(nèi)，金屬絡合物催化反應的機理往往不同于生物體內(nèi)金屬催化的反應機理。因此，如果能把非生物體系的催化中間體應用到生物體系，那么就能大大擴展生物體內(nèi)酶促反應的應用范圍。為了達到這個目標，化學家已經(jīng)發(fā)展了一系列策略，比如酶的定向進化及人工金屬酶的設計。但是，這些策略應用范圍仍然極其有限。作為金屬有機化學領域的一類重要中間體，單核金屬–氫負中間體能夠參與許多有機反應；但是利用單核金屬–氫負為反應中間體的酶促反應在自然界中并不存在。在生物體內(nèi)，與鋅離子協(xié)同催化反應的酶非常普遍，其中的碳酸酐酶更是早已被深入研究。簡單來說，碳酸酐酶是把二氧化碳轉化為碳酸，反應機理經(jīng)過了一個路易斯酸和氫鍵的協(xié)同催化作用以實現(xiàn)氫氧根對二氧化碳的加成（圖1a左）。在此背景下，加州大學伯克利分校的Hartwig課題組設想如果能把二氧化碳親電試劑換為酮，同時把被轉移的氫氧根換成氫負離子，那么碳酸酐酶就實現(xiàn)了對酮的還原（圖1a右）。同時考慮到酶促反應的手性環(huán)境，該反應極有可能會具有優(yōu)秀的對映選擇性，這樣就可以在不使用復雜NADPH復雜輔基（圖1b）的情況下實現(xiàn)羰基的酶促不對稱還原。在此思路引導下，他們發(fā)展了一個利用硅氫試劑為還原劑，能夠高立體選擇性地還原酮為手性二級醇的新反應（圖1c）。該工作近期發(fā)表在《Nat. Chem.》上。
圖1：研究背景及該文工作。圖片來源：Nat. Chem.在有機化學領域，烷氧鋅或者氟化鋅試劑能夠與硅氫反應生成Zn-H中間體。鑒于此反應，作者設想，當向碳酸酐酶促反應中添加硅氫還原劑時，原有的烷氧鋅就有可能與硅氫反應生成Zn-H中間體。在確定了研究切入點后，作者選擇4–乙酰基吡啶1為底物，評估了不同硅氫試劑的還原活性（表1），最終發(fā)現(xiàn)當使用PhSiH3為還原劑時反應效果最好（99%收率，98% e.e.值，entry 1）。對照反應表明，硅氫試劑對該不對稱還原反應極為重要。把PhSiH3更換為PhMeSiH2時，雖然對映選擇性不變，但是反應產(chǎn)率降為78%（entry 2）。當把把PhSiH3更換為PhMe2SiH、Et3SiH、(Me3SiO)2MeSiH、(iPr)2SiH2時，反應則完全不能發(fā)生（entry 3-7）。不出意外，在無酶參與的條件下，反應也不能進行（entry 8）。進一步的對照反應表明，不同的碳酸酐酶具有不同的催化活性：在各種碳酸酐酶中，hCAII的反應活性最高（entry 9-10）。表1：不對稱還原反應的條件優(yōu)化。圖片來源：Nat. Chem.在酶促反應研究領域，反應中使用的酶往往需要通過蛋白純化技術得到，但是蛋白提純往往極為耗時。從實用性角度來講，如果能直接使用含有目標酶的整個細胞進行催化反應，無疑就會大大提高反應效率。所以，作者進一步研究了利用含有最優(yōu)碳酸酐酶的整個細胞來催化該還原反應的可能性（圖2）。如圖2a所示，純化的酶、含有酶的正常整個細胞、在零下20 C存放三天的正常整個細胞及凍干的含有酶的整個細胞都能催化反應。雖然不同環(huán)境下的酶都能以高對映選擇性還原底物，但是在零下20 C存放三天的正常整個細胞催化反應的產(chǎn)率卻僅有46%，而另外三種條件下的酶都能以95%的收率還原底物酮（圖2a）。隨后，作者選用了含有氘代原子的PhSiD3 作為氫源來參與反應。結果表明，D原子以99%的 比例被引入到還原產(chǎn)物中（圖2b）。為了進一步研究該反應的實用性，作者進行了放大規(guī)模實驗。在克級規(guī)模下，標準反應底物的產(chǎn)率為93%、e.e. 值為97%（圖2c）。圖2：應用細胞進行不對稱還原。圖片來源：Nat. Chem.在確定了最優(yōu)反應條件后，作者評估了該酶促還原反應的底物使用范圍（表2）。結果表明，許多苯乙酮類底物都能被高效還原。除了簡單的苯乙酮（7），對位含有不同取代基的苯乙酮也能以優(yōu)秀產(chǎn)率、幾乎完美的對應選擇性被還原（8-12）。鄰位、間位的取代基對反應也幾乎沒有影響（13-14，17）。但是當鄰位取代基為-Cl時（15），反應的對應選擇性降為80%，對于底物16，對應選擇性又重回95%。所以，該反應的取代基及位阻效應似乎并沒有一個統(tǒng)一的規(guī)律。對于非苯乙酮類底物，反應也能成功進行（18-22）。除了苯環(huán)及萘環(huán)外，其他雜環(huán)酮類底物，包含吡啶、噠嗪、呋喃及噻吩也能被兼容（23-28）。對于二羰基底物，反應能高選擇性、高產(chǎn)率地還原具有較小位阻的羰基（29-30）。表2：適用于該反應的底物范圍。圖片來源：Nat. Chem.從機理角度來講，路易斯酸和硅氫還原劑協(xié)同還原酮為醇可以經(jīng)過以下兩種反應機理：第一種是鋅離子作為路易斯酸活化羰基，然后硅氫直接產(chǎn)生氫負離子進攻活化的羰基最終生成醇；第二種是鋅與硅氫反應生成Zn-H中間體，然后該金屬氫負中間體還原酮為醇。所以，在不加酮底物的時候，通過判斷是否能產(chǎn)生氫氣就能區(qū)分這兩種反應機理，這是因為硅氫與水反應不會產(chǎn)生氫氣但是金屬氫負中間體則能與水反應生成氫氣。所以，作者就做了對照反應（圖3a）：在無底物參與的條件下，在正常水作為溶劑時，反應放出了H2；而在氘代水作為反應溶劑時，反應放出的則為HD。該實驗有利證明了反應經(jīng)歷了一個鋅與PhSiH3生成的Zn-H中間體。在排除了鋅離子作為路易斯酸活化底物羰基的反應機理后，作者又提出了另外兩種可能的反應機理（圖3b）：第一種是與鋅配位的氫氧根作為堿與硅氫配位后可以活化硅氫，活化的硅氫可以直接還原羰基；第二種則是通過一個Zn-H中間體還原羰基。如果反應是經(jīng)過圖3b所示的第一種機理的話，那么具有不同產(chǎn)生氫負離子能力的硅氫就會具有不同的反應效果；如果是第二種，則不會有明顯的差別。在此思路下，作者對比了不同硅氫的還原能力（圖3c）。PhSiH3和PhMeSiH2相比，PhMeSiH2具有更強的產(chǎn)生氫負的能力；但是對照反應卻顯示在該反應中，兩者的還原能力幾乎一樣。該實驗就排除了圖3b中的第一種假設而間接證明了第二種機理。為了獲得更多的數(shù)據(jù)來支撐Zn-H中間體的生成，作者合成了三配位的Zn-O和Zn-F中間體，然后觀察其能否與硅氫反應生成Zn-H結構。結果證實，在模擬碳酸酐酶的三配位環(huán)境下，Zn-O和Zn-F中間體都能與硅氫反應生成Zn-H結構（圖3d）。圖3：酶促還原反應機理研究。圖片來源：Nat. Chem.為了進一步研究該反應的反應機理，作者運用了QM/MM方法對反應機理做了計算。計算結果表明，PhSiH3、反應底物都能合理地與酶促反應位點結合；同時反應位點附近的氨基酸也能通過氫鍵作用活化底物中的羰基（圖4a-d）。在綜合所有證據(jù)后，作者提出了如下的反應機理：天然的碳酸酐酶中的Zn反應位點可以與硅氫試劑進行作用而生成Zn-H中間體，隨后被氫鍵活化的羰基底物可以被該氫負試劑還原，還原得到的烷氧中間體與水作用后生成目標還原產(chǎn)物同時實現(xiàn)酶活性位點的循環(huán)（圖4e）。在作者進行底物普適性探索時，作者發(fā)現(xiàn)，當鄰溴苯乙酮為反應底物時，反應的非對映選擇性僅僅為10%（圖4f）。為了研究該底物為何如此特殊，作者特別運用計算方法模擬了該底物與酶可能的結合方式。結果表明，除了氫鍵作用外，溴原子也可以通過鹵鍵作用與酶結合。兩種不同的作用使得Re、Si結合方式能量差別不大，進而使得酶的手性環(huán)境并不能區(qū)分這兩種結合方式，最終造成還原該底物時的對映選擇性極低（圖4g，4h）。圖4：氫負離子產(chǎn)生及轉移過程的計算研究。圖片來源：Nat. Chem.總結：在這篇文章中，Hartwig課題組報道了一個利用碳酸酐酶作為催化劑、硅氫作為還原劑還原酮為二級醇的新方法。該方法能夠以高產(chǎn)率、高對映選擇性還原不同的酮，同時能夠兼容不同的官能團及雜環(huán)，具有極強的實用價值。更重要的是，該反應巧妙結合了自然界中存在的天然酶與實驗室中的非天然還原劑，成功實現(xiàn)了天然酶不能實現(xiàn)的新反應，為發(fā)展其他酶促反應提供了新思路。Ji, P., Park, J., Gu, Y. et al. Abiotic reduction of ketones with silanes catalysed by carbonic anhydrase through an enzymatic zinc hydride. Nat. Chem. (2021). https://doi.org/10.1038/s41557-020-00633-7
來源：高分子科學前沿
